DOT1L在胃癌組織中的表達及其與預后的相關性

宋早智 王慶康 孫家和 劉雪 錢軍

蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤外科（安徽蚌埠233000）

胃癌（gastric cancer）是最常見的惡性腫瘤之一，胃癌的發病率在世界排在第五位，而其死亡率達到了第3 位。而在中國，胃癌的發病率在所有惡性腫瘤中排在第2 位，死亡率排在第3 位。各國的癌癥數據報告顯示，近幾年的胃癌發病率趨于穩定并有逐年下滑的趨勢，但我國的胃癌發病率仍舊很高，占世界總發病率的40%以上［1-2］。

類端粒沉默干擾體1（disruptor of telomeric silencing 1-like，DOTIL）是一個在進化上保守的蛋白，在芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）中通過篩選遺傳基因時被首次發現，在低等生物中被稱為DOT1（disruptor of telomeric silencing 1）蛋白，而在哺乳動物中保守的同源蛋白被稱為DOT1 樣蛋白，DOT1L 的過量表達則可以擾亂端粒的沉默。有研究表明DOT1L 不僅在白血病［3］中起關鍵作用，在實體腫瘤中也有重要作用，乳腺癌中提高DOT1L 表達量，可能增加BCAT1 表達，從而導致乳腺癌細胞球形形成和細胞遷移活性的改變［4］。卵巢癌中，DOT1L 通過H3K79 甲基化過表達轉錄調控CDK6 和CCND3 來驅動細胞周期進展，提示DOT1L 可能是卵巢癌預后評估和治療干預的潛在靶點［5］。前期筆者通過Western Blot 發現，與癌旁正常組織相比，胃癌新鮮組織中DOT1L 表達量增高。然而尚未有學者就DOT1L 在胃癌中的表達及作用進行報道。因此，本研究通過免疫組化檢測80例胃癌及對應癌旁正常組織中DOT1L 表達情況，旨在探討DOT1L 在胃癌中表達及其與臨床病理特征和預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取蚌埠醫學院第一附屬醫院于2018年6-12月在腫瘤外科進行胃癌手術患者25例。所有病人術前均未接受過放療化療及其他抗腫瘤治療，并于術前均有明確診斷及術后再次診斷為癌。共納入25例癌組織及其相匹配的正常非癌性胃黏膜組織（距離腫瘤邊緣＞4 cm）。手術切除后，立即放入-80 ℃冰箱保存，直至提取mRNA 及蛋白質。本研究已經通過蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準并取得患者知情同意。

1.2 主要試劑TRIzol?Plus RNA Purification Kit和Revert Aid First Strand cDNA short kit 由美國Invitrogen 公司生產；Power SYBR?Green PCR Master Mix 由瑞士Roche 公司生產；兔抗人DOT1L 單克隆抗體及兔抗人β-actin 單克隆抗體、鼠抗兔IgG 二抗均購自英國Abcam 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒由美國Thermo Fisher Scientific 公司生產。

1.3 胃癌DOT1L mRNA 提取、逆轉錄及qRTPCR 反應取胃癌及相配對的癌旁正常組織，使用TRIzol-氯仿-異丙醇法提取總RNA 后，逆轉錄cDNA。進行實時熒光定量PCR（引物由上海吉凱公司提供，引物序列見表1，以cDNA 為模板，β-actin 為內參，采用2-△△Ct方法計算DOT1L 的表達量。反應條件：（1）變性95 ℃15 s，（2）退火60 ℃25 s，（3）延伸72 ℃34 s。共40 個循環。

表1 PCR 引物序列表Tab.1 PCR primer sequence table

1.4 Western Blot 檢測胃癌組織中DOT1L 蛋白取胃癌及相配對的癌旁正常組織，提取總蛋白，BCA 試劑盒進行蛋白定量。取60 μL 總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后以4%BSA封閉2 h，漂洗。DOT1L 一抗以1∶1 000 稀釋，β-actin 一抗以1∶2 000 稀釋，4℃孵育過夜，漂洗。二抗以1∶5 000 稀釋，室溫孵育1 h，T-TBS 漂洗，顯色。用Image J 分析目的條帶與內參條帶灰度值的比值來計算目的蛋白相對表達量。

1.5 免疫組化檢測DOT1L 蛋白選取蚌埠醫學院第一附屬醫院于2013年1月到2013年12月在腫瘤外科手術的胃癌組織蠟塊80例，進行切片制備、脫臘、復水后對組織進行抗原修復，然后進行免疫反應，滴加一抗（1∶200），4 ℃冰箱孵育過夜。加二抗（1∶500），室溫孵育1 h。DAB 化學染色，蘇木素復染。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。陽性染色結果判斷：胞漿中的染色面積和棕黃色顆粒決定是否為陽性細胞。

1.6 免疫組化結果判斷采用二次計分法：每例標本隨機計數5 個高倍視野（× 400），計數每個高倍視野中陽性細胞所占百分比。染色強度標準如下［6］：以基本色度標準，0 分無色，1 分淡黃色，2分棕黃色，3 分棕褐色。再將陽性細胞所占百分比計分，0 分為陰性，1 分為陽性細胞＜10%，2 分為11%～50%，3 分為51%～75%，4 分為＞75%。用染色強度得分和細胞數得分的乘積作為判斷表達結果，若積分0～4 分為陰性，4～12 分為陽性。因此，本研究將DOT1L 陰性表達患者歸為低表達組，陽性表達歸為高表達組。免疫組化結果由兩名以上高年資病理醫師同時讀片評定。

1.7 統計學方法采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析，兩組間比較用配對t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，單因素及多因素分析采用Cox 比例風險回歸模型，生存分析采用Kaplan-Meier 法計算。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DOT1L mRNA 在胃癌組織中表達與癌旁正常組織相比，胃癌組織中DOT1L mRNA 的表達水平明顯增加，兩者差異性具有統計學意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 胃癌組織與對應癌旁正常組織DOT1L mRNA 的表達Fig.1 Expression of DOT1L mRNA in gastric cancer tissues and adjacent tissues

2.2 DOT1L蛋白表達在胃癌組織中的表達DOT1L蛋白在170 kDa 處出現，以β-actin 為內參對照，DOT1L 蛋白在胃癌組織中明顯高于癌旁正常組織中表達，見圖2。

圖2 胃癌組織（T）與癌旁正常組織（N）DOT1L 蛋白表達狀況Fig.2 Expression of DOT1L protein in gastric cancer tissue（T）and paracancer normal tissue（N）

2.3 免疫組化檢測DOT1L 蛋白表達在80例胃癌組織蠟塊和與其相匹配的癌旁正常組織中，DOT1L 蛋白在癌組織中陽性表達明顯高于癌旁正常組織（P＜0.001），見表2。DOT1L 陽性反應物定位于細胞胞漿中，見圖3。

表2 DOT1L 在胃癌組織和癌旁正常組織的表達情況Tab.2 Expression of DOT1L in gastric cancer tissues and adjacent tissues 例（%）

圖3 免疫組化檢測DOT1L 蛋白在胃癌和癌旁正常組織的表達（×400）Fig.3 The expression of DOT1L protein in gastric cancer and adjacent normal tissues was detected by immunohistochemistry

2.4 DOT1L 蛋白表達與胃癌臨床病理特征的相關性為了闡明DOT1L 潛在的預后作用，通過對免疫組化結果與患者臨床病理資料的統計學分析可以發現，DOT1L 在胃癌中的表達與DOT1L 蛋白的表達量與分化程度（P＝0.002）、TNM 分期（P＝0.022）、淋巴轉移（P＝0.032）有關，與年齡（P＝0.251）、性別（P＝0.808）、腫瘤部位（P＝0.450）、腫瘤大小（P＝0.489）和浸潤深度（P＝0.703）無關，見表3。

2.5 DOT1L蛋白表達與胃癌患者預后的關系本組80例患者隨訪時間60 個月，死亡62 人，總生存率22.5%。對DOT1L 在胃癌中的表達進行K-M 分析，胃癌組織中DOT1L 陽性患者總體生存率（P＜0.001）顯著高于DOT1L 陰性患者，見圖4。

2.6 胃癌預后單因素及多因素分析采用Cox 比例風險模型分析后，單因素結果顯示，DOT1L 陽性表達，侵犯程度T3-T4，TNM分期高，淋巴結轉移，分化程度低是影響胃癌預后的危險因素。多因素分析顯示，DOT1L陽性表達，淋巴結轉移，TNM分期高是影響胃癌預后的獨立因素（均P＜0.05），見表4。

圖4 胃癌患者DOT1L 高表達組與DOT1L 低表達組5年生存率比較Fig.4 The 5 years survival rate in the DOT1L overexpression group was significantly lower than that in the DOT1L low expression group

3 討論

近些年來，胃癌的治療主要方式仍是以手術治療為主，術前新輔助化療和術后化療放療相結合為輔。這對于胃癌伴淋巴結轉移的患者，明顯提高了手術的療效和患者的生存時間，但仍有超過一半的患者發生了局部復發和遠處轉移［7］。因此，對于胃癌患者早期發現、早期診斷、早期治療對于病情控制、治療方式選擇、生存時間顯得尤為重要。通常胃癌通過鋇劑造影，彩超等進行篩查。而早期確診則要通過胃鏡取材，病理檢驗得到。這種方法入侵性強，傷害較大，對于患者較為不利。因而尋找胃癌相關的生物學指標，通過血清腫瘤標志物的檢測對于早期胃癌的篩查具有重要意義。

表3 DOT1L 表達與患者臨床病理因素的關系Tab.3 Relationship between DOT1L expression and clinicopathological factors in patients

眾所周知，DOT1L 作為酵母中DOT1 的人類同源物，是組蛋白H3 第79 位賴氨酸（H3K79）的特異性的甲基轉移酶。最近的研究表明，DOT1L 通過與MLL 融合伴侶蛋白（例如AF4，AF9，AF10 或ENL）結合，參與混合譜系白血病（MLL）- 重排白血病的起始和維持，導致H3K79 甲基化和過表達異常［8-10］。因此，對于這種類型的白血病，DOT1L的小分子抑制劑是一個非常重要的治療靶點［11］。在實體臟器的惡性腫瘤中，YANG 等［12］認為，DOT1L 表達較高，經過腎透明細胞癌手術后的病人，其生存時間分期預后都較低表達患者更差。然而在紫外線誘導的黑色素瘤中，ZHU 等［13］卻發現，DOT1L 和甲基化的H3K79 結合到DNA 損傷位點進行核苷酸切除修復，這表明，DOT1L 在紫外線誘導的黑色素瘤過程中起保護作用。這種與重排型白血病中DOT1L 所對應的靶基因不同，從而產生不一樣的作用。

表4 DOT1L 表達以及臨床特征對胃癌患者生存率的影響Tab.4 Impacts of DOT1L expressions，as well as clinical characteristics on the survival rates of gastric cancer patients

DOT1L 在腫瘤細胞的侵襲增殖信號途徑中起著重要作用。在本課題中，筆者已經發現，正常胃組織中DOT1L 的表達情況明顯低于癌組織中的表達，并且DOT1L 蛋白的表達與分化程度、TNM 分期、淋巴轉移有關。通過多因素分析，DOT1L 高表達、TNM 分期、淋巴結轉移與胃癌患者預后有明顯的相關性。這些都提示DOT1L 可能是一種原癌基因，由此我們可以判斷，檢測胃癌組織中DOT1L 蛋白量有助于判斷腫瘤的惡性程度和進展狀態。但此實驗仍無法對DOT1L 在胃癌中分子機制層面進行研究。下一步我們將進行胃癌不同種細胞間差異性分析，并通過敲低DOT1L 表達量，觀察細胞增殖變化，

綜上所述，DOT1L 在胃癌組織中存在基因和蛋白高表達的現象，其表達的強弱與胃癌的臨床病理學具有相關性。