骨肉瘤組織中巨噬細胞炎性蛋白4的表達及其與肺轉移的相關性

丁曉敏 胡海燕

上海交通大學附屬第六人民醫院腫瘤內科（上海200233）

骨肉瘤是最常見的原發性骨腫瘤，其好發于兒童和青少年。骨肉瘤最常見的好發部位是長骨的干骺端，如股骨遠端及脛骨近端等［1］。由于醫學技術的迅猛發展，現通過新輔助化療、手術切除、輔助化療、靶向治療和免疫治療等多種方式聯合治療，原發性骨肉瘤患者的5年內生存率已經被提高到70%左右［2-3］。但是骨肉瘤極易發生局部復發和早期轉移，肺轉移占據了骨肉瘤患者轉移部位的80%以上［4］。一旦發生肺轉移，患者的5年內生存率就降低至20%～30%。因此，探究骨肉瘤轉移的相關機制極為重要。

巨噬細胞炎癥蛋白4（macrophage inflammatory protein 4，MIP4）即趨化因子配體18（chemokine ligand 18，CCL18），屬于CC 趨化因子家族成員，與CCL13 分子結構最為相似，CCL18 與其他巨噬細胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein，MIPs）一起位于17 號染色體上［5］。該基因本身有3 個外顯子和2 個內含子，但與其他趨化因子不同的是，CCL18 的第一個內含子中包含2 個假外顯子（最終肽中不出現的外顯子）。通過這些假外顯子，人們認為MIP4/CCL18 是由CCL13 樣蛋白編碼基因之間的基因融合事件所產生的，并且由于積累突變，CCL18 隨著時間的推移獲得了不同的功能［6］。MIP4/CCL18 在不同的白介素因子刺激下與PITPNM3，GPR30，CCR8 等不同受體結合，在機體的炎癥反應和免疫應答中發揮了各種作用［7］。除此之外，也有一些研究表明MIP4/CCL18 在多種腫瘤中高表達，并與腫瘤的轉移和進展相關，例如PINTO 等［8］發現MIP4/CCL18 在進展期的結直腸癌中高表達并介導了巨噬細胞分化、癌細胞侵襲這一過程。然而，MIP4/CCL18 在骨肉瘤中的研究鮮有報道。因此，本研究旨在評估MIP4/CCL18 在骨肉瘤原發組織和肺組織的表達情況，并探討其與患者的預后關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2011年1月至2013年12月來我院診治的骨肉瘤繼發肺轉移病人的原發灶腫瘤組織標本75例及配對的肺組織標本31例。所有患者均經病理確診且病人信息完整。組織標本均來自手術和穿刺活檢，標本經過4%甲醛固定后石蠟常規包埋。每個標本切片厚度是4 μm，連續切片不低于5 張。

1.2 方法及結果判定免疫組織化學采用SABC法進行染色，步驟參考試劑盒說明書。兔抗人一抗MIP4/CCL18 濃度為1∶100，山羊抗兔二抗濃度為1∶500。免疫組化試劑盒以及所有抗體均購于博士德生物工程有限公司。

免疫組織化學結果判定標準：細胞胞漿中出現棕黃色顆粒則為陽性，隨機選取五個視野在高倍鏡下觀察計數（1）染色強度評分：不著色0 分，黃色1 分，棕黃色2 分，黃褐色3 分；（2）陽性細胞所占比例評分：陽性細胞數≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，≥76%為4 分。最終結果以染色強度和染色范圍評分的乘機表示：陰性＝0 分，弱陽性＝1～4 分，陽性＝5～8 分，強陽性＝9～12 分，取中位值分為高表達組＞6 分，低表達組≤6 分。

1.3 統計學方法使用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。根據資料類型，采用Spearman 相關分析分析MIP4/CCL18 在原發組織和肺組織中表達量的關系。采用卡方分析分析MIP4/CCL18 表達量與骨肉瘤臨床病理特征之間的關系，采用Kaplan-Meier 生存分析及Cox 風險回歸模型分析判斷預后，當P＜0.05 時分析，差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織中MIP4/CCL18 的表達在所有病例中，MIP4/CCL18 在原發灶中的表達為10.85 ±3.73，在肺轉移灶中的表達為8.51 ± 2.96。根據免疫組織化學結果判定標準將所有患者的原發灶評分都計算出來，接著取中位值，患者被分為低表達組和高表達組（5.29 ± 0.95vs. 11.45 ± 4.24）（圖1）。

圖1 原發灶和肺轉移灶CCL18 表達情況Fig.1 CCL18 expression in primary tissue and lung tissue

2.2 MIP4/CCL18 表達水平相關分析經Spearman 相關分析發現，MIP4/CCL18 在骨肉瘤原發灶及其肺轉移灶中的表達具有相關性（r＝0.527，P＜0.05）。MIP4/CCL18 與骨肉瘤患者臨床病理特征的關系見表1，卡方分析顯示，MIP4/CCL18 的表達量與患者的年齡、性別、腫瘤大小、壞死情況、病理類型及局部復發等方面的差異均無統計學意義（P＞0.05），但與臨床分期和發生肺轉移方面的差異具有統計學意義（P＜0.05）。利用Cox 風險回歸模型分析結果顯示，MIP4/CCL18 的表達量是骨肉瘤肺轉移預后的獨立危險因素（OR＝1.307，P＜0.05）。

表1 骨肉瘤組織中CCL18 的表達與臨床病理特征的關系Tab.1 Relationship between CCL18 expression and clinical features of OS samples

2.3 生存分析本研究的隨訪時間為6～36 個月，在所有75例患者中，35例因死亡而終止隨訪，其余40例至終點時仍生存。經統計分析，MIP4/CCL18 高表達組患者的總生存率較低表達組患者組低（P＜0.05）。見圖2。

3 討論

骨肉瘤的發展是一個多因素、多機制參與的復雜過程，早期易發生肺轉移是其重要特點，也是影響患者生存預后的一大難題。目前，已有不少研究表明，腫瘤的增長和轉移與其所處的微環境密切相關［9］。腫瘤相關巨噬細胞作為微環境的重要組成部分，其合成分泌的一系列細胞因子和趨化因子在腫瘤的侵襲、轉移、血管生成和免疫抑制等生物學行為中發揮著重要作用［10］，其中，M2 型巨噬細胞與腫瘤發生轉移的關系尤為密切［11-12］。

圖2 CCL18 低表達和高表達患者的Kaplan-Meier 生存曲線Fig.2 Kaplan-Meier survival curve of patients with low/high CCL18 expression

MIP4/CCL18 是一種由M2 型巨噬細胞分泌的趨化因子［13］，它在多種腫瘤組織中都具有高表達。PHAM 等［14］通過RT-qPCR 驗證了MIP4/CCL18在乳腺癌組織中的高表達情況并通過體內異種移植模型驗證了MIP4/CCL18 可以通過觸發IL-32θ所抑制的通路來促進乳腺癌的轉移。WANG 等［15］的研究證實了在食管癌組織中MIP4/CCL18 的高表達意味著患者會有更差的預后，而且MIP4/CCL18 通過上調HOTAIR 促進了食管鱗狀細胞癌的進展。ZHOU 等［16］則通過免疫組化檢測了MIP4/CCL18 在膽囊癌組織和正常組織的表達，揭示了MIP4/CCL18 在癌組織中的表達明顯高于正常組織，考慮其可能通過激活PI3K/Akt 這一信號通路來促使癌細胞發生遷移和侵襲。QIN 等［17］人用ELISA 檢測了132例頭頸部鱗狀細胞癌患者，25例癌前病變患者及32例健康受試者的血樣，發現頭頸部鱗狀細胞癌患者血樣中MIP4/CCL18 的水平高于其他人，并揭示了MIP4/CCL18 是通過MTDH-NF-κB 這條通路來促進癌細胞的轉移。不過，也有一些研究揭示了不同的現象。WU 等［18］發現胃癌早期患者外周血中MIP4/CCL18 的水平高于晚期。YUAN 等［19］分析了371例結腸癌患者癌組織中的MIP4/CCL18 表達水平，結果顯示MIP4/CCL18 高表達患者的總生存率較長，由此可見MIP4/CCL18 在腫瘤中的作用并不單一、絕對。

目前MIP4/CCL18 在多種腫瘤中的表達情況及作用機制相繼被揭示，但國內外卻少有關于MIP4/CCL18 在骨肉瘤中的相關研究。本研究采用免疫組織化學染色的方法檢測了骨肉瘤原發組織和肺轉移組織的MIP4/CCL18 表達情況，結果發現原發灶MIP4/CCL18 高表達者，其肺轉移灶的MIP4/CCL18 水平也會增高，接著筆者通過Spearman 相關分析證實了這兩者之間的相關性，后續的Cox 模型也表明了MIP4/CCL18 是影響骨肉瘤患者肺轉移預后的獨立危險因素。曾經LIU 等［20］的研究指出，MIP4/CCL18 通過結合其同源受體PITPNM3 來激活下游信號通路從而促進了乳腺癌的侵襲轉移，當MIP4/CCL18 與PITPNM3 的結合被阻斷后，雖然異種移植模型的腫瘤生長未停止，但是肺轉移卻得到了抑制，由此可見，MIP4/CCL18 是影響腫瘤侵襲和肺轉移的重要因子。接著，筆者在對75例骨肉瘤患者的臨床病理特征分析中發現，MIP4/CCL18 的表達水平與臨床分期及肺轉移相關，生存期隨訪也顯示了MIP4/CCL18 高表達組患者的總生存率低于低表達組，這預示著MIP4/CCL18 可以在臨床上用作預測骨肉瘤患者預后的重要指標。

總之，MIP4/CCL18 在骨肉瘤發生肺轉移的過程中起著重要作用，它既可以作為提示骨肉瘤患者發生肺轉移的預測因子，也對指導骨肉瘤患者的臨床預后有著重要的意義。不過，MIP4/CCL18促骨肉瘤肺轉移的具體機制仍有待進一步研究，之后才有望為骨肉瘤的靶向治療提供新的理論依據。