顱腦損傷后認(rèn)知障礙大鼠模型的制備及評價*

郭新榮 馬小衛(wèi)

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，西安 712046)(2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)教務(wù)處，西安 712046)

顱腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)是臨床常見創(chuàng)傷之一，常導(dǎo)致意識喪失、失語、眩暈、頭痛、認(rèn)知障礙及各種神經(jīng)功能障礙等[1]。患者多以青壯年為主，男性居多，認(rèn)知障礙(Cognitive disorder，CD)為多數(shù)患者伴有的最持久和最嚴(yán)重的癥狀之一，特別是學(xué)習(xí)新知識的能力減退[2-3]，給個人、家庭和社會帶來了沉重負(fù)擔(dān)[4]，故對TBI認(rèn)知功能障礙的有效防治引起了越來越多的醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注[5]。在科學(xué)研究工作中急需尋求一種能夠較好模擬認(rèn)知障礙，同時穩(wěn)定性、重復(fù)性好，便于操作的動物模型平臺及評價體系，目前此方面研究較少，本實驗探索了TBI后認(rèn)知障礙大鼠模型的制備及評價，報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康清潔雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量220～240 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SCXK(陜)2012-003號。自然光照，自由飲水、進(jìn)食，溫度18～24 ℃、濕度60%～70%，嚴(yán)格按照2006年國家科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)意見》管理動物。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，水迷宮篩除不適合納入實驗的大鼠12只，其余動物按隨機(jī)數(shù)字表分為空白組10只，假手術(shù)組10只，模型組28只。

1.2 主要藥品及試劑

戊巴比妥鈉(57-33-01)；鹽酸利多卡因注射液(161093)；注射用氨芐西林鈉(華北制藥股份有限公司，批號：D1604204，0.5 g/支)；Rat MMP-2、Rat MMP-9、Rat SOD、Rat MDA ELISA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要儀器

微型磨鉆；腦立體定位儀(ST-3ND型，成都儀器廠)；電子顱腦損傷儀(eCCI-6.3，美國VCU 大學(xué))；自動酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司 SpectraMax5)；臺式離心機(jī)(TL-4型，湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠)；恒溫水浴鍋(SHHW21.60A11型，天津市泰斯特儀器有限公司)；水迷宮(上海移數(shù)鼠博士，RD1101MWM-G)等。

1.4 各組動物處理

模型組：顱腦損傷動物模型制備：(1)術(shù)前禁食禁水8 h；(2)腹腔內(nèi)注射2%的戊巴比妥鈉(45 mg/kg體質(zhì)量)進(jìn)行麻醉；(3)將大鼠俯臥位固定于腦立體定向儀上；(4)頭頂正中皮膚碘伏、酒精消毒，正中切開，剝離骨膜，暴露右頂骨；(5)利用腦立體定位儀進(jìn)行定位，在冠狀縫后3 mm、中線右側(cè)旁開2.5 mm處[6]制作標(biāo)記；然后以標(biāo)記點為圓心、用微型磨鉆鉆半徑為2 mm的骨窗，保持硬腦膜完整。利用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量確保所開骨窗直徑為4 mm，否則進(jìn)行修整；(6)將大鼠移置到eCCI操作臺上，進(jìn)行打擊(速度4 m/s、深度3 mm)，撞擊桿撞擊硬膜，使腦組織產(chǎn)生瞬間形變；(7)打擊后創(chuàng)面如有出血，用消毒干棉球進(jìn)行壓迫止血；后利用注射器向傷口處滴注 4萬單位硫酸慶大霉素 4～5 滴，用骨蠟封閉骨窗；(8)用1.0號手術(shù)線縫合頭皮；(9)術(shù)后處理：縫合后立即用紅霉素軟膏涂抹縫合處及周圍。將大鼠放在棉墊上，保持呼吸暢通，注意保暖，約2～3 h，待大鼠完全蘇醒后放回鼠籠中飼養(yǎng)；(10)術(shù)后抗感染：注射氨芐西林鈉，每次用量125 mg，生理鹽水稀釋后，腹腔注射，每日1次，連用3 d。

空白組：不做任何處理。

假手術(shù)組：同模型組開顱，但不打擊。

1.5 TBI認(rèn)知障礙動物模型篩選

待以上手術(shù)動物恢復(fù)3 d后，將模型組所有動物進(jìn)行水迷宮實驗(僅進(jìn)行定位航行實驗)，將各自的總成績計算，并排序。有研究[7]指出70%～80%的腦外傷幸存患者存在認(rèn)知功能障礙，故本實驗選取前70%的動物納入實驗研究。

1.6 術(shù)后大鼠生命體征、神經(jīng)功能及運動功能評價方法

1.6.1觀察實驗大鼠受到外傷后出現(xiàn)的生命體征變化，并且記錄打擊后出血量的情況、呼吸、抽搐、意識障礙、致死情況。

1.6.2神經(jīng)行為能力[8]:制作一個長30 cm、寬30 cm的木板。參考Faden等使用的大鼠實驗性顱腦創(chuàng)傷神經(jīng)功能行為評分標(biāo)準(zhǔn)，具體評價標(biāo)準(zhǔn)：大鼠在30度傾斜板上保持位置的能力(包括垂直、左右兩側(cè)水平三種方向)；懸吊大鼠尾部，左右前肢屈曲能力；對抗左右兩側(cè)牽拉的能力。每項0～5分(重傷—-正常)，正常大鼠計分應(yīng)為15分。

1.6.3大鼠平衡功能試驗[8]:制作一根長30 cm、寬1.5 cm的木條。當(dāng)大鼠放置在木條上時，動物在木條上的平衡狀態(tài)可作為評分條件。具體評分方法：1分，平穩(wěn)不動；2分，比較平穩(wěn)，稍微晃動；3分，較大晃動；4分，站在木條上一段時間后從懸掛在木條上掉下；5分，站在木條上一段時間后從木條上掉下；6分，無法站在木條上，立即從木條上掉下。評分越高，動物的平衡功能障礙越顯著。

1.6.4鼠行走試驗：具體方法[8]:行走試驗是由一根長100 cm、寬1.5 cm木條和一個長20 cm、寬15 cm、高20 cm木盒組成。動物聽到噪聲時，大鼠會從木條一端逃到另一端木盒中。正常大白鼠通過若干次訓(xùn)練，能在5 s之內(nèi)完成這個過程。通過測試大鼠完成行走試驗的時間來判斷動物的運動功能，時間越長，動物運動功能障礙越明顯。測量時使用智能手機(jī)上自帶的秒表計時器計時測量。

1.7 Morris水迷宮實驗

1.7.1定位航行實驗：大鼠依次從4個象限進(jìn)入水中，若90 s內(nèi)爬上平臺，記錄所用時間；若90 s內(nèi)未找到平臺，潛伏期則記錄為90 s。連續(xù)訓(xùn)練4 d，每日上、下午各1次。每次的游泳結(jié)果，取四個象限的逃避潛伏期之和。動物在造模后第4天開始水迷宮實驗，持續(xù)12次。

1.7.2空間探索實驗：定位航行實驗最后一次結(jié)束后1天的上午，撤除平臺，將實驗大鼠放入水中，觀察、記錄大鼠90 s內(nèi)經(jīng)過原平臺所在區(qū)域次數(shù)。

1.8 血清MMP-2、MMP-9、SOD和MDA含量檢測

待第12次水迷宮實驗結(jié)束時，大鼠麻醉，腹主動脈取血，3 000轉(zhuǎn)/分離心，取血清，-20 ℃冰箱保存以供檢測使用。ELISA實驗操作步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。結(jié)果判定：在Excel表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、對應(yīng)A值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

1.9 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后大鼠生命體征、神經(jīng)功能及運動功能結(jié)果

2.1.1各組動物出血情況:根據(jù)eCCI不同強(qiáng)度打擊動物出血量情況，采用團(tuán)隊前期研究制定[9]的分級標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

2.1.2打擊時大鼠抽搐、術(shù)后呼吸情況和存活情況，見表2。

表1 各組動物造模時出血情況Table 1 Bleeding in each group during modeling

注：模型組造模過程中死亡4只，存活24只；假手術(shù)組死亡2只，存活8只
Note:In the model group,4 rats died and 24 survived in the process of modeling;in the sham operation group,2 rats died and 8 rats survived

表2 各組動物造模后抽搐、呼吸情況和存活情況Table 2 Convulsion,respiration and survival of animals in each group after modeling

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.01
Note:Compared with the Sham operation group，#P<0.01

2.1.3神經(jīng)功能行為能力：術(shù)后當(dāng)日，術(shù)后3日，實驗結(jié)束時檢測各組動物的行為學(xué)能力(見表3)，方法參考文獻(xiàn)[10]。

表3 各組動物神經(jīng)行為能力評分比較Table 3 Comparison of neurobehavioral abilities of animals in each group

注：與術(shù)后當(dāng)日比較，#P<0.01；與術(shù)后3日比較，*P<0.01
Note:compared with the postoperative day,#P<0.01;compared with the postoperative day,*P<0.01

2.1.4大鼠平衡功能

術(shù)后當(dāng)日，術(shù)后3日，實驗結(jié)束時檢測各組動物平衡功能結(jié)果，見表4。

表4 各組動物平衡能力評分比較Table 4 Comparison of balance ability of animals in each group

注：與術(shù)后當(dāng)日比較，#P<0.01；與術(shù)后3日比較，★P<0.01
Note:compared with the postoperative day,#P<0.01;compared with the postoperative day,★P<0.01

2.1.5大鼠行走試驗：術(shù)后當(dāng)日，術(shù)后3日，實驗結(jié)束時檢測各組動物行走功能情況。測量時使用智能手機(jī)上自帶的秒表計時器，見表5。說明正常動物均能夠在5秒內(nèi)完成行走試驗。

表5 各組行走試驗的時間(s)比較Table 5 Comparison of walking test

注：與術(shù)后當(dāng)日比較，#P<0.01；與術(shù)后3日比較，★P<0.01
Note:compared with the postoperative day,#P<0.01;compared with the postoperative day,★P<0.01

2.2 Moriss大鼠水迷宮評價

2.2.1大鼠水迷宮潛伏期實驗：結(jié)果見表6，圖1。

表6 大鼠水迷宮潛伏期時間比較Table 6 Comparison of latency of water maze in rats

注：與空白組比較，#P<0.01；★P>0.05
Note:compared with the blank group,#P<0.01；★P>0.05

圖1 水迷宮典型軌跡圖Fig.1 typical path of water maze

2.2.2空間探索實驗：結(jié)果見表7。

表7 各組大鼠穿過平臺所在位置數(shù)次)Table 7 number of positions of rats in each group passing through the platform times)

注：與空白組比較，#P<0.01；★P>0.05
Note:compared with the blank group,#P<0.01;★P>0.05

2.3 血清中認(rèn)知障礙標(biāo)志物MMP-2、MMP-9、SOD、MDA含量

2.3.1MMP-2、MMP-9蛋白含量：當(dāng)動物實驗終止時，腹主動脈抽血，對各組動物血清中的MMP-2、MMP-9含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果：與空白組比較，模型組血清MMP-2、MMP-9含量明顯上升(P<0.01)，而假手術(shù)組含量沒有變化(P>0.05)，見表8。

表8 血清中MMP-2、MMP-9含量的情況Table 8 contents of MMP-2 and MMP-9

注：與空白組比較，#P>0.05;與空白組、假手術(shù)組比較，*P<0.01
Note:Compared with the blank group,#P>0.05;Compared with blank group and sham operation group,*P<0.01

2.3.2血清中SOD、MDA含量：當(dāng)動物實驗終止時，腹主動脈抽血，對各組動物血清中的SOD、MDA含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果：與空白組比較，模型組血清SOD含量明顯下降(P<0.01)，MDA含量明顯上升(P<0.01)，而假手術(shù)組SOD、MDA含量均沒有變化(P>0.05)。見表9。

表9 血清中SOD、MDA含量的情況Table 9 content of SOD and MDA in serum

注：與空白組比較，#P>0.05;與空白組、假手術(shù)組比較，*P<0.01
Note:Compared with the blank group,#P>0.05;Compared with blank group and sham operation group,*P<0.01

3 討論

本研究選用動物模型制備的基本方法筆者已發(fā)表過相關(guān)研究論文[11]；團(tuán)隊近年一直使用本造模方法，該方法穩(wěn)定，可靠性較強(qiáng)。本次為了進(jìn)一步研究TBI后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生，在原有模型基礎(chǔ)上引入了水迷宮篩選。結(jié)合水迷宮研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)模型組動物與空白組、假手術(shù)組比較水迷宮實驗潛伏期大大延長、空間探索實驗也表現(xiàn)較差，確實發(fā)生了認(rèn)知功能障礙；同時，空白組和假手術(shù)組比較沒有差異，這說明除打擊導(dǎo)致顱腦損傷外，手術(shù)等操作沒有造成影響。同時，實驗也對大鼠生命體征、神經(jīng)功能行為學(xué)及運動功能進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示：SD大鼠顱腦受到手術(shù)、外力打擊后，動物出血量增加，呼吸減慢，死亡動物數(shù)也隨之增加。于打擊后當(dāng)日動物蘇醒后，對其神經(jīng)功能、平衡能力、行走能力進(jìn)行了評價，顯示結(jié)果與空白組比較，造模組有顯著性差異，假手術(shù)組也有差異。造模后第3日進(jìn)行評估，假手術(shù)組神經(jīng)功能、平衡、行走能力均明顯恢復(fù)；但是，模型組動物神經(jīng)功能、平衡、行走能力雖然均有明顯恢復(fù)，但是仍然存在顯著性差異。當(dāng)實驗結(jié)束時，模型組動物神經(jīng)功能、平衡、行走能力均明顯改善，同術(shù)后3日點比較，均有明顯改善，但是，與正常組比較，仍然存在差異。結(jié)果說明這一模型制備策略穩(wěn)定可靠，可供同類研究使用。

進(jìn)一步實驗選擇了具有認(rèn)知障礙標(biāo)志物的公認(rèn)指標(biāo)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)進(jìn)行研究。MMP是一組鋅離子依賴的內(nèi)肽酶家族[12]，目前已發(fā)現(xiàn)人類MMPs 有20多種，其中MMP-2、MMP-9是MMPs 家族的核心成員，與阿爾茨海默病(AD)的關(guān)系密切，影響其發(fā)生發(fā)展；近年來成為一種認(rèn)知功能障礙的標(biāo)志物，越來越多地被應(yīng)用在認(rèn)知障礙的研究中。SOD是細(xì)胞內(nèi)生的氧自由基清除劑可以清除體內(nèi)代謝產(chǎn)生的氧自由基；MDA是氧自由基作用于細(xì)胞膜脂的產(chǎn)物，其濃度變化能夠間接反映氧自由基的含量變化，兩者作為細(xì)胞代謝的一對研究指標(biāo)，已經(jīng)是目前已經(jīng)被許多研究所公認(rèn)的結(jié)果。許多學(xué)者[13-14]將SOD、MDA作為研究顱腦損傷認(rèn)知功能的重要觀察指標(biāo)之一。本研究將血清中MMP-2、MMP-9、SOD和MDA作為TBI后認(rèn)知障礙標(biāo)志物進(jìn)行觀察，是否能得到理性的效果呢？在實驗中，探索TBI后認(rèn)知障礙的動物模型制備效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組動物血清中MMP-2、MMP-9、MDA含量明顯升高，但是，假手術(shù)組和空白組均表達(dá)低水平，且兩組之間比較沒有差異；發(fā)現(xiàn)模型組動物血清中SOD含量明顯下降，同樣，假手術(shù)組和空白組均表達(dá)一般水平，且兩組之間比較沒有差異。這些觀察結(jié)果證明了TBI后認(rèn)知障礙大鼠血清中MMP-2、MMP-9、SOD和MDA含量確實發(fā)生了變化；同時也說明我們使用血清中這4種物質(zhì)的含量變化作為TBI后認(rèn)知障礙觀察標(biāo)志物是可行的；也從一定程度證明我們制備的TBI后認(rèn)知障礙的有效可靠性。

綜上，本實驗研究了TBI后認(rèn)知功能大鼠模型制備的策略和評價方法，使用水迷宮篩選、檢測血清中MMP-2、MMP-9、SOD、MDA的含量等是可靠度較高的評價方法，本模型制備方法操作可行，結(jié)果可靠，可供同類研究應(yīng)用。