IL-17在鼻息肉形成中的作用機制

董慶喆，李慎玲，連媛媛，徐禛，張念凱，姜曉丹

摘要：目的 ?檢測白介素-17（IL-17）及其受體（IL-17R）在鼻息肉和正常鼻黏膜中的表達及IL-17在鼻息肉患者血清中的表達，觀察IL-17 在鼻息肉發病過程中可能的作用機制和意義。方法 ?鼻息肉組織及血清標本來自青島大學附屬醫院耳鼻咽喉科2016年11月～2017年11月行鼻息肉切除術的42例患者，選取10例同期行上頜竇囊腫手術切除的正常中鼻道黏膜組織作為正常鼻粘膜對照，10例健康成年人血清作為正常對照。HE 染色用于常規組織病理學檢查，免疫組織化學染色觀察IL-17及其受體表達水平及部位，雙重免疫組織化學染色觀察表達IL-17的細胞，ELISA法檢測血清中IL-17蛋白表達水平。結果 ?①42例鼻息肉組織中IL-17和IL-17R陽性細胞數較正常鼻黏膜組織中多，差異有統計學意義（P<0.05）;巨噬細胞表面標志（CD68）在鼻息肉組織中的表達比正常鼻黏膜組織高，差異有統計學意義（P<0.05）。②IL-17及CD68雙重免疫組化染色顯示IL-17主要表達于鼻息肉巨噬細胞上，IL-17R主要表達于上皮層基底細胞、腺管基底細胞及血管內皮細胞。③42例鼻息肉患者血清中IL-17蛋白水平和健康成年人比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論 ?IL-17對鼻息肉的形成作用可能是通過影響巨噬細胞的功能及相關細胞因子實現的，IL-17與IL-17受體的相互作用可能參與鼻息肉的病理改變，如上皮細胞基底膜增厚及腺體增生等。

關鍵詞：鼻息肉;白介素-17受體;巨噬細胞

中圖分類號：R765.25 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.22.019

文章編號：1006-1959（2019）22-0059-04

The Mechanism of Action of IL-17 in the Formation of Nasal Polyps

DONG Qing-zhe1，LI Shen-ling2，LIAN Yuan-yuan2，XU Zhen2，ZHANG Nian-kai2，JIANG Xiao-dan2

（Department of Biological Specimen1，Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery2，

Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，Shandong，China）

Abstract：Objective ?To detect the expression of interleukin-17 （IL-17） and its receptor （IL-17R） in nasal polyps and normal nasal mucosa and the expression of IL-17 in serum of patients with nasal polyps， and to observe the incidence of IL-17 in nasal polyps. Possible mechanisms and implications of the process. Methods ?Nasal polyps and serum samples were obtained from 42 patients with ENT， from November 2016 to November 2017 in the Department of Otorhinolaryngology， Affiliated Hospital of Qingdao University. Ten normal nasal mucosa were removed from the maxillary sinus cyst. Tissue was used as a normal nasal mucosa control and 10 healthy adult sera were used as normal controls. HE staining was used for routine histopathological examination. The expression level and location of IL-17 and its receptor were observed by immunohistochemical staining. The cells expressing IL-17 were observed by double immunohistochemical staining. The serum IL-17 protein expression was detected by ELISA level.Results ?①The number of IL-17 and IL-17R positive cells in 42 cases of nasal polyps was higher than that in normal nasal mucosa，the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression of macrophage surface marker （CD68） in nasal polyps was higher than that in normal nasal mucosa，the difference was statistically significant （P<0.05）.②IL-17 and CD68 double immunohistochemical staining showed that IL-17 was mainly expressed on nasal polyp macrophages， and IL-17R was mainly expressed in epithelial basal cells， glandular basal cells and vascular endothelial cells.③There was no significant difference in serum IL-17 protein levels between 42 patients with nasal polyps and healthy adults （P>0.05）. Conclusion ?The formation of IL-17 on nasal polyps may be achieved by affecting the function of macrophages and related cytokines. The interaction of IL-17 with IL-17 receptor may be involved in the pathological changes of nasal polyps membrane thickening and glandular hyperplasia.

Key words：Nasal polyps;Interleukin-17 receptor;Macrophage

慢性鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP）是一種常見病，發病率及復發率均較高，其致病機制至今尚未明確，目前普遍認為是多因素共同作用的結果，如感染性因素、嗜酸性粒細胞浸潤及鼻變態反應等。近年來，Th17細胞被認為是一個獨立的輔助T細胞亞群，以分泌IL-17A（亦稱IL-17）為主要特征[1]。IL-17A是IL-17家族（IL-17A-F）的基礎成員，是一種致炎細胞因子，可以促進T細胞的激活和刺激成纖維細胞、內皮細胞、巨噬細胞、上皮細胞產生多種致炎因素，包括IL-1β、IL-6、IL-8、誘導性NO合酶、環氧化酶2、前列腺素E2[2]，而這些因子與鼻息肉的發病均有著密切的關系。IL-17在腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNAF6）參與下與IL-17受體結合，激活核因子κB（NFκB）和活化蛋白-1，進而調節促炎性細胞因子的活性[3]。基于此，本研究通過對鼻息肉組織中及鼻息肉患者血清中的IL-17進行檢測，旨在探討其在鼻息肉發病中的作用。

1材料與方法

1.1材料來源 ?鼻息肉組織標本來自青島大學附屬醫院耳鼻咽喉科2016年11月～2017年11月行鼻息肉切除術的42例患者。其中男25 例，女17 例，年齡17～68歲，平均年齡（38.27±14.38）歲，均無過敏、支氣管哮喘及阿司匹林耐受不良病史，術前2周無應用類固醇激素史。10例鼻黏膜對照組織來自同期因上頜竇囊腫行手術切除的正常中鼻道黏膜組織，其中男8例，女2例，年齡31～49歲，平均年齡（38.20±8.06）歲。鼻息肉患者血清標本來自上述42例鼻息肉患者，10例正常對照組血清來自同期我院體檢中心的健康體檢人員，其中男性6例，女性4例，年齡20～50歲，平均年齡（37.26±7.14）歲。本研究所有操作均取得研究對象同意，簽署同意書，并經過青島大學附屬醫院倫理委員會審批通過。

1.2試劑 ?兔抗人IL-17多克隆抗體來自Santa Cruz Biotech公司，羊抗人IL-17受體多克隆抗體來自R&D Systems Inc公司;鼠抗人CD68單克隆抗體購自福州邁新生物技術公司;人IL-17 ELISA 試劑盒（96孔板）購自Biosource 公司;雙重免疫組化試劑盒、SP免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術公司。

1.3檢測方法

1.3.1 SP免疫組化染色 ?所有組織標本以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，做4 μm 厚的連續切片。按照產品說明書采用鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶（SP）技術對標本進行常規免疫組化染色，一抗分別滴加IL-17多克隆抗體、IL-17受體多克隆抗體及CD68單克隆抗體。二氨基聯苯（DAB）顯色，Mayer 蘇木素復染，封片。以胞漿或胞膜有棕黃色染色者為陽性細胞。用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.3.2雙重免疫標記 ?選擇10例 IL-17高表達的病例，用雙重免疫標記方法確認 IL-17陽性表達的細胞類型。免疫組化步驟同前，但分2次滴加一抗，先滴CD68單克隆抗體，行堿性磷酸酶染色，陽性細胞胞質為藍色。再滴加 IL-17多克隆抗體，行過氧化物酶染色，陽性細胞胞質為猩紅色，同時表達CD68和IL-17的陽性細胞胞質為暗紫色。Mayer蘇木素復染，封片。

1.3.3酶聯免疫吸附試驗 ?所有外周血靜置30～60 min，3000 r/min，離心15 min，分離得血清，-80℃凍存。嚴格按照ELISA試劑盒產品說明書操作流程行血清中IL-17 蛋白水平檢測，用ELISE檢測儀測定OD值，根據標準曲線，計算出檢測血清中IL-17蛋白濃度。

1.4結果判定 ?所有切片在光學顯微鏡下觀察，IL-17、IL-17受體及CD68 陽性染色呈褐色，觀察其在鼻息肉組織和對照組織中表達水平及部位。每個切片中隨機選取10個高倍視野，每個視野計數100個細胞中的陽性細胞數，取各視野陽性細胞表達的平均數作為陽性細胞表達率。

1.5統計學處理 ?采用SPSS 22.0統計軟件處理數據，使用（x±s）表示，比較行t檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1 IL-17表達比較 ?IL-17陽性反應呈棕褐色，主要存在于細胞漿。在鼻息肉組織中，IL-17 主要表達于較大的單個核細胞的細胞漿，少量表達于多形核細胞及漿細胞的細胞漿、棘細胞層上皮細胞，見圖1。鼻息肉中IL-17陽性細胞數（6.33±1.98）個，較正常鼻黏膜組織中的（2.06±1.02）個多，見圖2，差異有統計學意義（t=12.286，P<0.05）。

2.2 CD68 表達比較 ?CD68陽性反應呈褐色，主要存在于細胞漿，均為較大的單個核細胞，少數為多形核細胞，呈散在分布，見圖3。鼻息肉組織中巨噬細胞（CD68）陽性細胞數為（5.36±1.34）個，較正常鼻黏膜組織中的（1.49±0.52）個多，見圖4，差異有統計學意義（t=14.641，P<0.05）。雙重免疫標記結果：CD68 及IL-17 同時標記于一種較大細胞的胞質中，呈暗紫色，此細胞為巨噬細胞，見圖5。

2.3 IL-17R表達比較 ?IL-17R 陽性反應呈棕褐色，主要存在于細胞膜及細胞漿。在鼻息肉組織中，IL-17R主要表達于上皮層基底細胞膜、腺管基底細胞及小血管內皮細胞，見圖6、圖7。鼻息肉中IL-17R陽性細胞數為（11.34±2.33）個，較下鼻甲中的（2.52±0.77）個多，差異有統計學意義（t=20.352，P<0.05）。

2.4血清中IL-17 表達比較 ?42例鼻息肉患者血清中IL-17蛋白濃度為（84.74±11.47）pg/ml，與正常對照組的（87.27±9.65）pg/ml比較，差異無統計學意義（t=0.646，P>0.05）。

3討論

鼻息肉是由復雜的多因素、多基因共同作用的結果，其本質是鼻黏膜的慢性炎性病變。嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、成纖維細胞及上皮細胞均可參與激活、釋放、誘導和調節多種細胞因子、生長因子等，通過多種方式調節炎性過程，導致鼻息肉形成[4]。

IL-17主要由活化的Th17細胞產生，Th17細胞近來被認為是一個獨立的輔助T細胞亞群，以分泌IL-17為主要特征。Th17細胞在防御胞外微生物感染、介導慢性炎癥和自身免疫性疾病的發病機制中發揮重要作用[1]。研究認為鼻息肉多數表達為Th2反應細胞因子（高水平IL-5）和嗜酸細胞標志物（嗜酸細胞陽離子蛋白-ECP、嗜酸細胞活化趨化因子-eotaxin）以及IgE的增高。隨著對Th17細胞的深入研究[5]，Th1/Th2/Th17的免疫平衡機制在鼻息肉形成機制中的作用還有待深入研究。

鼻息肉是鼻黏膜的慢性炎癥性疾病，組織學特征是大量的炎性細胞浸潤，包括肥大細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和漿細胞等。上皮層和固有層的改變，例如杯狀細胞增生、細胞外基質蛋白沉積、水腫、腺體增生和基底膜增厚[6]。IL-17是一種致炎細胞因子，可以促進T 細胞的激活和刺激成纖維細胞、內皮細胞、巨噬細胞、上皮細胞產生多種致炎因素[2，3]，這些因子與鼻息肉的發病均有著密切的關系。IL-17在TNAF6參與下與IL-17受體結合，激活NFκB和活化蛋白-1，進而調節促炎性細胞因子的活性[3]。本研究結果發現IL-17主要表達于巨噬細胞，而巨噬細胞作為粘膜固有層內重要的免疫效應細胞，具有非特異性殺傷作用及抗原遞呈作用，還可以合成和分泌多種細胞因子如白細胞介素1及6、腫瘤壞死因子（TNF）等[7]。本研究證實IL-17 主要表達于鼻息肉組織的巨噬細胞，且表達量較正常鼻黏膜組織明顯增多，提示IL-17可能通過影響巨噬細胞的功能及相關細胞因子的作用，影響鼻息肉的免疫及炎癥狀態。此外，本研究結果顯示，鼻息肉患者血清中IL-17蛋白水平與健康對照組基本一致，進一步說明IL-17 在鼻息肉的形成過程中發揮一種局部的免疫應答反應。而這種局部的免疫應答反應可能通過巨噬細胞及相關細胞因子實現的。另外，本研究還發現IL-17受體特異性強表達于上皮層基底細胞及腺管基底細胞，提示IL-17與IL-17R 的相互作用可能參與鼻息肉腺體增生和基底膜增厚等病理改變，從而促進鼻息肉的生長，亦提示Th17細胞可能參與鼻息肉的病理改變。

綜上所述，IL-17及其受體與鼻息肉的發病有一定關系，IL-17可能通過影響巨噬細胞的功能及相關細胞因子的作用，影響鼻息肉的免疫及炎癥狀態。此外，IL-17與IL-17R 的相互作用可能參與鼻息肉的病理改變，如腺體增生及基底膜增厚，可能促進鼻息肉的發生發展。

參考文獻：

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收稿日期：2019-8-27;修回日期：2019-9-7

編輯/成森