NaCl脅迫對大豆生理特征的影響

于磊　劉宗林　徐宗藝　屈申　楊少彤

摘要? [目的]對大豆在不同濃度的NaCl鹽脅迫下的生理指標進行測定與分析。[方法]以大豆幼苗為研究材料，設置NaCl濃度梯度，對大豆幼苗施加NaCl鹽脅迫，測定其丙二醛含量、SOD活性、POD活性、游離脯氨酸含量、葉綠素含量、電導率等生理指標。[結果]在鹽濃度遞增的情況下，丙二醛含量呈遞增趨勢;SOD先增后減，在鹽濃度125 mmol/L時達到峰值;POD先平緩后遞增;游離脯氨酸含量整體呈遞增趨勢;葉綠素含量整體呈遞增趨勢，增長較緩慢，最終趨于穩定;電導率變化沒有規律可循，在125 mmol/L時達到峰值。[結論]NaCl鹽脅迫會影響大豆的生理指標，說明大豆植株的生理狀況隨生長環境的改變而改變，大豆植株對不斷變化的環境具有一定的適應能力。

關鍵詞? 大豆;鹽脅迫;丙二醛;POD;葉綠素

中圖分類號? Q945??? 文獻標識碼? A

文章編號? 0517-6611（2019）24-0039-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.013

Physiological Characteristics of Soybean under NaCl Stress

YU Lei1，2，LIU Zong-lin1，XU Zong-yi1 et al? （1.School of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040;2.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040）

Abstract? [Objective]The physiological indexes of soybean under different NaCl stress were measured and analyzed.[Method]With soybean seedlings as research materials，NaCl concentration gradient was designed.After applying NaCl salt stress to soybean seedlings，the physiological indexes such as malondialdehyde content，SOD，POD，free proline content，chlorophyll content and electrical conductivity were measured.[Result]Through the determination of physiological indexes of soybean seedlings，the content of malondialdehyde increased in the case of increasing salt concentration;the SOD value increased first and then decreased，and reached the peak value when the salt concentration was 125 mmol/L;the POD value increased first and then increased;the content of proline showed an increasing trend;the overall chlorophyll content showed an increasing trend，the growth was slow firstly and finally stabilized;the conductivity change did not follow the law，reaching a peak at 125 mmol/L.[Conclusion]NaCl salt stress can affect the physiological indexes of soybean，indicating that the physiological condition of soybean plants varies with the change of growth environment，and soybean plants have certain adaptability to environmental change.

Key words? Glycine max（Linn.） Merr;Salt stress;Malondialdehyde;POD;Chlorophyll

基金項目? 大學生創新訓練課題（201810225127）。

作者簡介

于磊（1992—），男，山東萊陽人，博士研究生，研究方向：林木遺傳育種;劉宗林（1998—），男，山東煙臺人，從事植物生理研究;劉宗林和于磊為共同第一作者。

收稿日期? 2019-06-14;修回日期? 2019-06-25

大豆通稱黃豆，是雙子葉植物綱、豆科、大豆屬的一年生草本植物，其莖直立、粗壯，密被褐色長硬毛。大豆中國重要糧食作物之一，是1種種子含有豐富植物蛋白質的作物。大豆可以用來榨取豆油，制作各種豆制品以及釀造醬油。

鹽脅迫對植物的種子萌發、生長發育以及基因表達都會造成不同程度的影響，會影響植物的生理狀態。滲透調節能耗、碳同化量減少和維持生長能耗增加等原因，多數植物在鹽脅迫下生長發育會受到顯著抑制[1];葉綠素酶活性提高導致葉綠素的降解，因此許多植物在鹽脅迫下光合色素含量降低[2]，但是低濃度的鹽脅迫可以促進植物體內光合色素含量的增加[5-6];在鹽脅迫條件下，植物細胞內產生大量的活性氧自由基，打破了正常情況下自由基產生與清除的動態平衡，使膜脂雙分子層過氧化，產生大量的丙二醛，并造成細胞膜結構破壞和電解質大量滲漏，使植物生理失調[3-4];鹽分能增加細胞膜透性，使脂質過氧化作用變強，最終導致膜系統的破壞[7];當遭受鹽脅迫時，植物常常通過抗氧化系統中的酶類和非酶類抗氧化物質之間的協同作用來抵御鹽脅迫引起的氧化脅迫[9];鹽脅迫下，細胞可以通過積累一些物質，如脯氨酸、多胺、可溶性糖等來調節細胞內的滲透勢，維持水分平衡，還可以保護細胞內許多重要代謝活動所需的酶類活性[8];植物在逆境中為了抵抗傷害，常常通過鹽脅迫應答基因的作用產生滲透調節物質脯氨酸，以保持原生質與環境的滲透平衡，增加蛋白質的可溶性，保持生物大分子結構的穩定性以維持細胞正常的滲透勢[10]。

該研究對大豆幼苗進行不同濃度梯度的NaCl溶液脅迫進行處理，進而對不同處理大豆幼苗的丙二醛含量、SOD活性、POD活性、游離脯氨酸含量、葉綠素含量、電導率等生理指標進行測定和比較分析，研究不同濃度NaCl脅迫對大豆植株生長和一些生理指標的影響，旨在探究大豆的耐鹽性，并初步闡明其適應鹽脅迫的生理機制，為今后在鹽堿地的推廣種植和促進大豆的產業發展提供實驗依據。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料? 以大豆種子自然萌發而得的長出三出復葉的大豆幼苗為試驗材料，試驗所用藥品有不同濃度的NaCl鹽溶液;10%三氧乙酸（TCA）、0.6%硫代巴比妥酸（TBA）;3%堿基水楊酸、2.5%酸性茚三酮顯色液、脯氨酸標準溶液;80% 丙酮;磷酸緩沖液;0.013 mol/L甲硫氨酸溶液、氮藍四唑、核黃素。

1.2? 試驗方法

對大豆幼苗分別施加0、50、75、100、125、150 mmol/L的NaCl鹽溶液進行脅迫處理，每組處理設置2個重復，鹽脅迫處理7 d后，取每組處理的三出復葉，進行生理指標的測定。

1.2.1? 丙二醛含量的測定。①取植物材料用液氮迅速研磨成粉，取0.5 g左右材料，置于5 mL離心管內;②加入5 mL 10%的三氯乙酸，提取30 min后，10 000? r/min離心15 min;③取上清液2 mL，加入2 mL 0.6%TBA，混勻，在100 ℃沸水浴中加熱15 min，冷卻后再測量;④分別測定600、532和450 nm處的吸光值，以2 mL TCA代替提取液為對照組。

1.2.2? 游離脯氨酸含量的測定。

①提取：剪碎葉片0.2 g置于大試管中，加入5 mL 3%堿基水楊酸溶液，用保鮮膜封口，于沸水浴中浸提10 min;②取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2 mL，加2 mL冰乙酸、2 mL水和4 mL顯色液，于沸水浴中加熱40 min，取出冷卻后向各管加入5 mL甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質。靜置待分層后吸取甲苯層樣品，在520 nm的波長下，以甲苯為對照進行比色;③記錄光密度值，從標準曲線中查出測定液中脯氨酸濃度，依據公式計算樣品中脯氨酸含量。

1.2.3? 葉綠素含量的測定。取新鮮葉片0.2 g，把葉片剪碎置研缽中，加入80% 丙酮研成勻漿，繼續研磨，至組織變白無綠色，離心并過濾，用80% 丙酮定容至25 mL，將葉綠素丙酮提取液分別在波長645、663 nm下測定吸光度，以80% 丙酮為空白，共3次重復。

1.2.4? POD值的測定。

取2只比色杯，一只比色杯加入3 mL反應混合液和1 mL磷酸緩沖液混勻作為校零對照，另一只比色杯加入3 mL反應混合液和1 mL酶液，立即秒表計時。于分光光度計470 nm波長下測量，每隔1 min讀數1次，以每分鐘OD值的變化來表示酶活性大小。

1.2.5? SOD值的測定。

①取植物材料0.5 g，用磷酸緩沖液迅速研磨成粉，置于7 mL離心管內;

②加入5 mL磷酸緩沖液，提取30 min后，在4 ℃下1 000 r/min離心15 min;

③取上清液0.1 mL置于試管中，加反應液及0.3 mL核黃素，于30 ℃、4級光照培養箱內反應7～8 min;

④另取2支試管，加入0.1 mL緩沖液、3.8 mL反應液、0.3 mL核黃素，一支試管置于黑暗處作為調零，另一支作為對照組，與試驗組一起進行照光處理。

1.2.6? 相對電導率的測定。取每組處理的葉片，盡量保證每組樣品的一致性，每組葉片都用打孔器打9個葉盤沒入20? mL ddH2O中，10 min后用DDS-11A型電導率儀測定電導率，記為R1;將溶液置于沸水浴中加熱30? min，待其冷卻后測定其電導率，記為R2。

2? 結果與分析

2.1? NaCl濃度對丙二醛含量的影響? 隨著NaCl濃度的增加，大豆植株葉片的丙二醛含量逐漸增加，且在125 mmol/L NaCl脅迫后丙二醛含量的增加變得更加顯著（圖1），而丙二醛會造成細胞膜結構的破壞，因此丙二醛含量越大，鹽脅迫對大豆植株的危害越大。

2.2? NaCl濃度對游離脯氨酸含量的影響

隨著NaCl濃度的增加，大豆植株葉片的游離脯氨酸含量整體呈遞增趨勢，且在100 mmol/L NaCl脅迫后游離脯氨酸含量的增加變得更加顯著（圖2），推測大豆植株通過大量合成脯氨酸，使細胞滲透勢降低，進而增強植株抗鹽性，以適應鹽脅迫環境。

2.3? NaCl濃度對葉綠素含量的影響

隨著NaCl濃度的增加，大豆植株葉片的葉綠素含量整體呈遞增趨勢，但增長趨勢較緩慢（圖3），推測大豆植株通過適當合成葉綠素來增強植株光合作用，提高合成植物生長必須物質的效率，幫助大豆適應鹽脅迫環境。

2.4? NaCl濃度對POD活性的影響? 隨著NaCl濃度的增加，大豆植株葉片的POD酶活性呈先減后增的趨勢，在75 mmol/L NaCl脅迫值時達到最低值，其后酶活增長十分明顯（圖4），推測大豆植株通過增強POD酶活性的方式清除過氧化物，幫助大豆適應高鹽環境。

2.5? NaCl濃度對SOD活性的影響? 隨著NaCl濃度的增加，大豆植株葉片的SOD酶活性呈先增后減的趨勢，在125 mmol/L NaCl脅迫值時達到峰值，其后酶活緩慢降低（圖5），推測大豆植株通過增強SOD酶活性的方式清除過氧化物幫助大豆抵御低鹽逆環境，但過高鹽濃度環境會降低SOD酶活性，阻礙過氧化物的清除，降低大豆耐鹽能力。

3? 結論與討論

植物對環境作出的反應既受基因的控制，又受個體所處的生存條件和生理生長狀況的制約[11]，由于碳同化量減少、滲透調節能耗和維持生長能耗增加等原因，多數植物在鹽脅迫下生長發育會受到顯著抑制[1]。該研究結果顯示，大豆植株中各生理指標都有明顯變化，推測大豆植株可通過改變生理狀況來適應鹽脅迫環境。

葉片光合色素含量直接反映了植物的光合能力[12]。該研究結果顯示，大豆植株葉綠素含量緩慢增長，未呈下降趨勢，推測大豆植株可能通過合成葉綠素增強光合作用，以此抵御鹽脅迫環境。但整體未呈下降趨勢，也可能是因為處理濃度不夠，在后續的試驗中可以增大NaCl濃度，驗證大豆植株在高鹽環境中的葉綠素含量變化。

植物在鹽脅迫條件下，細胞內產生大量的活性氧自由基，打破了正常情況下維持的自由基產生與清除的動態平衡，使膜脂雙分子層過氧化，產生大量的丙二醛，并造成細胞膜結構破壞，電解質大量滲漏，使植物生理失調[3-4];SOD和POD能夠分別清除O2-和H2O2[13-15]。該研究結果顯示，NaCl脅迫處理后大豆葉片MDA含量顯著提高，并且隨著鹽濃度的升高，MDA含量增長幅度越大;同時，POD和SOD酶活性明顯提高。推測鹽脅迫導致細胞內自由基大量產生，造成了大豆的膜脂過氧化傷害，同時誘導體內酶的抗氧化物質發揮作用，以增強細胞的抗氧化能力而清除體內的自由基，降低膜脂過氧化的程度，這與徐寧等[16]的研究結果一致。

植物在遭受鹽脅迫后，其細胞膜透性會增加，胞內電解質隨之外滲，因此導致植物細胞浸提液電導率增大[17]。在后續的試驗中會分析與完善鹽脅迫下大豆植株電導率數據，以便進一步豐富大豆抵御鹽脅迫的生理指標數據。

有研究認為，鹽脅迫下游離脯氨酸含量變化與植物抗鹽性存在正相關關系[18-19]，該研究大豆植株中游離脯氨酸含量隨鹽濃度的增加而增加。推測在鹽脅迫處理下，游離脯氨酸成為主要的滲透調節物質來維持滲透平衡，以減緩鹽分對大豆植株的侵害。

該研究通過對NaCl脅迫處理下的大豆植株進行生理指標的測定，歸納大豆植株在鹽脅迫處理下的生理狀況，推測大豆植株可以在低鹽環境中進行栽植。為了進一步研究大豆的抗鹽能力，可以采用復合鹽進行鹽脅迫試驗。該研究為大豆在自然鹽環境中的大量種植提供數據參考，為培育新型良種轉基因大豆提供參考依據，并豐富了逆境生物學理論。

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