青藏高原放牧家畜小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌LAMP檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

蔡其剛　唐一波　高小龍　仝麗娜　趙靜　張紅見(jiàn)

摘要? 為了建立特異性、敏感性和適用性強(qiáng)的LAMP檢測(cè)方法，采用分子生物學(xué)方法，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中該細(xì)菌的outL基因，進(jìn)行了多序列比對(duì)和保守區(qū)域確定。根據(jù)其保守序列，在線設(shè)計(jì)和篩選了一套LAMP引物。溫度優(yōu)化及特異性和敏感性驗(yàn)證后建立了檢測(cè)該病菌的LAMP檢測(cè)方法，并對(duì)青藏高原放牧牛、羊臨床糞便樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，LAMP檢測(cè)方法的最適溫度為63 ℃;檢測(cè)其與大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌及蠟樣芽胞桿菌無(wú)交叉反應(yīng);檢測(cè)下限為100 fg目的基因;利用建立的方法檢測(cè)了208份放牧牦牛、藏羊糞便DNA樣品，共檢測(cè)到26份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為12.5%。這表明成功建立了一種檢測(cè)該病的特異性、敏感性和適用性強(qiáng)的LAMP檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞? 放牧家畜;小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌;LAMP;outL基因;敏感性;特異性

中圖分類號(hào)? S852.6??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

文章編號(hào)? 0517-6611（2019）24-0107-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.032

Establishment and Application of LAMP Detection Method for Yersinia enterocolitica in Grazing Livestock in Qinghai-Tibet Plateau

CAI Qi-gang1，TANG Yi-bo2，GAO Xiao-long2 et al? （1.Academy of Animal Science and Veterinary Medicine，Qinghai University，Xining，Qinghai? 810016;2.College of Agriculture and Animal Husbandry，Qinghai University，Xining，Qinghai 810016）

Abstract? In order to establish a LAMP detection method with high sensitivity，specificity and applicability for Yersinia enterocolitica，outL gene sequences of Y.enterocolitica were downloaded from GenBank database to make multiple sequences blast by using molecular biology method.The conserved regions of the gene were determined.Based on the sequences of conserved gene，a set of LAMP primers were designed and screened out online.The LAMP method was established after temperature optimization，sensitivity and specificity verification.The clinical stool samples of grazing cattle and sheep were detected by the LAMP detection method.The results showed that the optimal temperature for LAMP detection method was 63 ℃.There was no cross-reactivity with Escherichia coli，Salmonella，Enterobacter sakazakii，Staphylococcus aureus，Pasteurella multocida and Bacillus cereus. The detection limit was 100 fg of the target gene.26 positive samples were detected among 208 fecal DNA samples of yak and Tibet sheep，the positive rate was 12.5%.These results demonstrated that a LAMP method for the detection of Y.enterocolitica with high sensitivity，specificity and applicability was established.

Key words? Grazing livestock;Yersinia enterocolitica;LAMP;outL gene;Sensitivity;Specificity

基金項(xiàng)目? 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31560695，31560701）;青海省農(nóng)牧廳項(xiàng)目（NMSY-2016-07，NMSY-2018-03）。

作者簡(jiǎn)介? 蔡其剛（1981—），男，河南商丘人，副研究員，博士，從事動(dòng)物疫病診斷防治研究。*通信作者，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事青藏高原畜禽傳染病的診斷與防治研究。

收稿日期? 2019-06-08

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）簡(jiǎn)稱耶氏菌，是一種革蘭氏陰性菌，能引起人和多種動(dòng)物的耶氏菌病。在歐洲，該病是常見(jiàn)的第三大食源性細(xì)菌性疾病，排在前2位的分別是腸沙門(mén)氏菌和空腸彎曲桿菌[1]。大多數(shù)情況下，該病都是由耶氏菌感染所致，可導(dǎo)致患病動(dòng)物產(chǎn)生各種臨床癥狀，如發(fā)燒、腹痛和腹瀉等[2]，在世界范圍內(nèi)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。其流行病學(xué)尚不清楚，通常認(rèn)為人感染該病主要是通過(guò)食用未煮熟的動(dòng)物產(chǎn)品或飲用污染了耶氏菌的水而感染[3-5]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是近年來(lái)發(fā)展較快的一種檢測(cè)方法，該方法最大的優(yōu)點(diǎn)是通常在1 h內(nèi)即可將目的基因擴(kuò)增到1×109 倍，且操作簡(jiǎn)單、快速、敏感性高和特異性強(qiáng)，無(wú)需特殊儀器。因此，LAMP方法已被廣泛應(yīng)用于包括多種細(xì)菌、病毒以及寄生蟲(chóng)等病原的快速檢測(cè)研究[6-9]。

為了檢測(cè)放牧牦牛、藏羊群中耶氏菌病的感染情況，進(jìn)而對(duì)環(huán)境中該病菌的污染情況和人感染風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，筆者針對(duì)該病菌的outL基因保守序列，綜合利用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，建立了LAMP快速檢測(cè)方法，并利用建立的LAMP檢測(cè)方法，對(duì)來(lái)自青海省和西藏自治區(qū)的208份放牧牦牛、藏羊糞便樣品進(jìn)行了檢測(cè)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 標(biāo)準(zhǔn)菌株與對(duì)照菌株。

耶氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC23715），購(gòu)自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司;對(duì)照菌株大腸桿菌（E.coli）、沙門(mén)氏菌（Salmonella）、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）及蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus），均由青海大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系獸醫(yī)傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2? 主要試劑及儀器。

1.1.2.1? 試劑。改良磷酸緩鹽沖液（PSB）培養(yǎng)基，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;細(xì)菌基因組快速抽提試劑盒，購(gòu)自北京艾比根生物技術(shù)有限公司;糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、核酸替代染料、6×Loading Buffer、DL-2 000 Marker、2×Taq PCR Master Mix，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;Loopamp DNA擴(kuò)增試劑盒（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法）及Loopamp熒光目視檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自榮研生物科技（中國(guó)）有限公司。

1.1.2.2? 儀器。實(shí)時(shí)濁度儀（型號(hào)為L(zhǎng)A-320C），購(gòu)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社;核酸蛋白測(cè)定儀（型號(hào)為Bio photometer plus），購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;核酸電泳儀（型號(hào)為DYY-12）購(gòu)自于北京六一生物科技有限公司;凝膠成像分析系統(tǒng)（型號(hào)為6300），購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.1.3? 引物。

根據(jù)NCBI網(wǎng)站中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的耶氏菌的outL基因（登錄號(hào)為CP009846.1），使用生物學(xué)軟件MEGA7.0比對(duì)outL基因的保守序列，按照LAMP方法的引物設(shè)計(jì)原則，在線（http：//primerexplorer.jp/elamp 4.0.0/index.html）設(shè)計(jì)并篩選針對(duì)outL基因的引物序列（表1）。HPLC級(jí)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4? 標(biāo)準(zhǔn)菌株及對(duì)照菌株DNA。

純培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC23715）和各對(duì)照菌株按照細(xì)菌基因組快速抽提試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA。

1.1.5? 臨床糞便樣品DNA。

208份放牧牦牛、藏羊臨床糞便樣品分別采自青海省河南縣、共和縣、格爾木市、雜多縣、久治縣與及西藏那曲地區(qū)和日喀則市等地區(qū)。取1 g左右收集的糞便，置于5 mL滅菌PSB中，25 ℃下恒溫?fù)u床增菌培養(yǎng)24 h。然后，4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，收集沉淀，用于糞便基因組總DNA提取，糞便DNA提取按照糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2? 方法

1.2.1? LAMP檢測(cè)的建立及條件優(yōu)化。

按照Loopamp DNA擴(kuò)增試劑盒推薦的體系建立耶氏菌LAMP檢測(cè)方法。反應(yīng)體系（總體積為25 μL）如下：DNA模板2 μL，2 × 反應(yīng)緩沖液（RM）12.5 μL，5 pmol/μL 的F3、B3引物各1 μL，40 pmol/μL的FIP、BIP引物各1 μL，20 pmol/μL 的LAMP熒光檢測(cè)試劑（FD）1 μL，BstDNA聚合酶1 μL，去離子水4.5 μL。反應(yīng)程序如下：60 ℃反應(yīng)60 min，80 ℃滅活5 min。

試劑盒推薦反應(yīng)時(shí)間為30～60 min。為了保證充分地?cái)U(kuò)增，首先擴(kuò)增60 min進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。為了摸索擴(kuò)增反應(yīng)的最適溫度，以標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC23715）DNA為模板，分別在60、61、62、63、64和65 ℃條件下，按照試劑盒推薦的體系使用實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，80 ℃滅活5 min后，將LAMP產(chǎn)物按1∶4稀釋后，取2 μL加上樣緩沖液進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2? LAMP特異性。

利用建立的LAMP檢測(cè)方法，在最適溫度下，以提取的標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC23715）及對(duì)照菌株的基因組DNA為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，80 ℃滅活5 min。將LAMP產(chǎn)物按1∶4稀釋后取2 μL加上樣緩沖液進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。同時(shí)，以ATCC23715為模板，利用LAMP外引物F3、B3進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后送交生工生物工程（上海））股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行在線比對(duì)，以驗(yàn)證引物的特異性。

1.2.3? LAMP敏感性。

將提取的標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC23715）的DNA使用核酸蛋白濃度測(cè)定儀進(jìn)行濃度測(cè)定，并進(jìn)行連續(xù)10倍倍比稀釋，即 1×10-1～1×10-8稀釋，對(duì)原液和稀釋后的DNA按照建立的LAMP方法，在最適溫度下進(jìn)行LMAP擴(kuò)增，80 ℃滅活5 min。取2 μL LAMP產(chǎn)物加上樣緩沖液進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4? LAMP臨床樣品的檢測(cè)。

利用建立的LAMP方法對(duì)臨床上采集并提取的208份糞便樣品的DNA進(jìn)行檢測(cè)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? LAMP反應(yīng)最適溫度的確定

以提取的標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC23715）DNA為模板，按照試劑盒推薦的25 μL反應(yīng)體系配制LAMP反應(yīng)液，并設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)。分別在60、61、62、63、64和65 ℃條件下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。將LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1∶4稀釋后進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果表明，陰性對(duì)照的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物沒(méi)有可見(jiàn)的DNA條帶，而加入DNA模板的6支PCR管中的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物均擴(kuò)增出“階梯狀”的DNA條帶，且反應(yīng)溫度為63 ℃的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物條帶最亮，DNA濃度最大，表明在63 ℃時(shí)LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效率最高，63 ℃是最適反應(yīng)溫度（圖1）。

2.2? LAMP反應(yīng)特異性檢測(cè)

利用建立的LAMP檢測(cè)方法，在最適溫度63 ℃下以提取的標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC23715）和其他6種對(duì)照菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示，只有標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC23715）擴(kuò)增出明顯的“階梯狀”的DNA條帶，而其他6株對(duì)照菌株和陰性對(duì)照均無(wú)可見(jiàn)DNA條帶，表明建立的LAMP方法具有良好的特異性（圖2）。同時(shí)，因?yàn)榉磻?yīng)體系中加入了1 μL的FD，在紫外線下可見(jiàn)陽(yáng)性樣品呈現(xiàn)綠色熒光，而陰性對(duì)照沒(méi)有熒光（圖3）。用LAMP外引物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC23715的DNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示獲得約240 bp大小的DNA條帶（圖4），與預(yù)期大小一致。PCR產(chǎn)物測(cè)序后返回的序列與目的基因進(jìn)行Blast比對(duì)，同源性達(dá)100%，因此LAMP和PCR擴(kuò)增的條帶均為目的基因。

2.4? LAMP反應(yīng)臨床樣品的檢測(cè)

利用建立的LAMP檢測(cè)方法，對(duì)來(lái)自臨床采集的208份放牧牦牛、藏羊糞便樣品提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果共檢測(cè)出陽(yáng)性樣品26份，陽(yáng)性率為12.5%（26/208）。

3? 討論與結(jié)論

耶氏菌是一種能引起人和動(dòng)物嚴(yán)重的腸道疾病，主要癥狀有腹瀉、胃腸炎、腸系膜淋巴結(jié)炎，嚴(yán)重的可引起敗血癥，在世界范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[10]。目前，針對(duì)耶氏菌的檢測(cè)，已經(jīng)建立了很多方法，主要有免疫學(xué)檢測(cè)和病原培養(yǎng)鑒定等[11-14]。此外，也有將病原培養(yǎng)、免疫和PCR檢測(cè)相結(jié)合，檢測(cè)食品中耶氏菌的報(bào)道[15]。然而，人們普遍認(rèn)為PCR和Real-time PCR是鑒定耶氏菌的最有效、靈敏、且特異的檢測(cè)方法[16-17]。

該研究通過(guò)對(duì)該細(xì)菌outL基因的保守序列，在線設(shè)計(jì)和篩選了一套LAMP引物，并建立了一種用于檢測(cè)耶氏菌的敏感性、特異性和適用性強(qiáng)的LAMP檢測(cè)方法。該方法通過(guò)LAMP技術(shù)檢測(cè)樣本中的DNA，與普通PCR技術(shù)相比LAMP方法對(duì)儀器和試驗(yàn)條件的要求更低，不需要專門(mén)的PCR儀。同時(shí)，LAMP方法的擴(kuò)增效率更高，在1 h內(nèi)即可做出定性判斷。結(jié)果判斷方法很多，除了可以進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳判定外，也可以根據(jù)濁度進(jìn)行肉眼判斷，或者在反應(yīng)液中加入熒光試劑，在紫外光下判定。后2種方法均不需要對(duì)擴(kuò)增后的反應(yīng)液進(jìn)行開(kāi)蓋，避免了DNA對(duì)試驗(yàn)環(huán)境的污染。與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、培養(yǎng)鑒定方法相比，LAMP方法操作步驟簡(jiǎn)便，對(duì)操作人員的要求更低，也降低了對(duì)環(huán)境的污染和操作人員感染的風(fēng)險(xiǎn)。這極大地縮短了檢測(cè)的總體時(shí)間，傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定至少需要5～6 d，而該方法在30 h內(nèi)即可做出結(jié)果判定，且可以對(duì)大量的臨床樣本進(jìn)行批量操作。

因此，在該病的檢測(cè)、預(yù)防和控制過(guò)程中，建立的該LAMP方法為該病大量樣本的流行病學(xué)調(diào)查及其風(fēng)險(xiǎn)分析提供了一個(gè)行之有效的檢測(cè)工具，應(yīng)在臨床上大量推廣使用。

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