抗根腫病大白菜近等基因系的構(gòu)建

張紅　黃志銀　李梅　范偉強(qiáng)　溫娟娟　王超楠

摘要? 為培育具有抗根腫病基因的青麻葉大白菜，豐富天津地方種質(zhì)資源，以優(yōu)良的青麻葉自交系H227作為輪回親本，12G57自交系作為抗根腫病基因的供體親本，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，在BC3F2世代即選育出4株輪回親本基因組含量為100%的純合抗性單株，快速高效地構(gòu)建了抗根腫的青麻葉近等基因系。從抗病性、農(nóng)藝性狀等方面分別對所獲得4個近等基因系進(jìn)行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表型均達(dá)抗病，主要農(nóng)藝性狀也均與輪回親本H227無顯著差異，表明今后不僅可用作青麻葉抗病育種實踐的材料，而且可作為根腫病抗病基因定位的最佳材料。

關(guān)鍵詞? 青麻葉大白菜;抗根腫病基因;近等基因系;分子標(biāo)記輔助選擇

中圖分類號? S634.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

文章編號? 0517-6611（2019）24-0128-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.039

Construction of Near-isogenic Lines of Chinese Cabbage with Clubroot Resistance

ZHANG Hong，HUANG Zhi-yin，LI Mei et al? （Tianjin Kerun Vegetable Research Institute， National Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation， Tianjin Key Laboratory of Vegetable Genetic and Breeding Enterprises， Tianjin 300381）

Abstract? In order to cultivate abutilon leaves Chinese cabbage with clubroot resistance gene and enrich local germplasm resources in Tianjin， taking excellent inbred lines H227 abutilon leave as recurrent parents， 12G57 inbred lines as the donor parents of clubroot resistance gene，four homozygous resistant plants with 100% genome content of recurrent parents were bred in BC3F2 generation， and the near-isogenic lines with resistance to clubroot disease were constructed rapidly and efficiently by using marker-assisted selection technology.From the aspects of disease resistance， agronomic characters of four near-isogenic lines，all the phenotypes were disease-resistant， and the main agronomic traits were not significantly different from the recurrent parent H227， indicating that it could not only be used as the material for disease resistance breeding of green leaves in the future， but also as the best material for the location of clubroot resistance gene.

Key words? Abutilon leave;Clubroot resistance gene;Near-isogenic lines;Marker-assisted selection

基金項目? 青年科研人員創(chuàng)新研究與實驗項目（2018013，2018003）;天津市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)專項計劃（ITTVRS2017003）。

作者簡介? 張紅（1990—），女，天津人，研究實習(xí)員，碩士，從事大白菜分子育種工作。*通信作者，副研究員，碩士，從事十字花科蔬菜育種研究。

收稿日期? 2019-09-03

青麻葉大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）是天津地區(qū)特有的一個地方性種質(zhì)資源，由于栽培效益好，復(fù)種指數(shù)高，市場范圍逐漸擴(kuò)大，發(fā)展前景可觀。但其本身缺乏抗根腫病基因，栽培中容易受到根腫病的侵害，加之近年來根腫病的迅速蔓延，青麻葉大白菜主要栽培地區(qū)均受到損害，在根腫病的高發(fā)地區(qū)，其品種品質(zhì)和產(chǎn)量均受到極大損害，嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致其全面退出市場。盡快培育出兼具抗病基因和青麻葉優(yōu)良性狀的大白菜品種迫在眉睫。

在育種中，常采取回交轉(zhuǎn)育的方法將目標(biāo)性狀轉(zhuǎn)移到優(yōu)良品種中去。經(jīng)過長期、大量的回交及田間選擇，選育出遺傳背景相近，僅目標(biāo)性狀存在差異的一組品系，即構(gòu)建近等基因系。它的優(yōu)勢在于不僅可以應(yīng)用于育種實踐，而且廣泛應(yīng)用于品種改良、基因多效性分析、目標(biāo)基因分離、基因精細(xì)定位和克隆等研究[1-6]，但這是一項長期而艱巨的工作，不僅工作量大，耗時、耗力而且往往依靠經(jīng)驗選擇，容易造成篩選誤差。分子標(biāo)記輔助（MAS）技術(shù)能夠在植物發(fā)育的任何時期利用種子或者葉片快速開展試驗[7]，簡化了篩選過程，開拓了一條更為高效的途徑，它也從分子水平上確保了篩選的真實性、準(zhǔn)確性。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者逐漸應(yīng)用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)在水稻、玉米、白菜等作物中開展研究[8-15]，但針對地方性種質(zhì)資源青麻葉大白菜的抗根腫病育種研究尚存在空白。該研究旨在利用分子標(biāo)記技術(shù)輔助選育出兼具抗病基因和青麻葉性狀的大白菜近等基因系，建立一套快速高效的近等基因系構(gòu)建體系，不僅可以豐富天津青麻葉大白菜的種質(zhì)資源，而且對提升該市大白菜分子育種水平和快速選育抗病品種具有重要的戰(zhàn)略意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試材來源。‘12G57含有抗根腫病基因CRb的大白菜[16]，作為供體親本;‘H227青麻葉大白菜，缺乏根腫病抗性基因，商品性狀優(yōu)良，作為輪回親本。2組材料均由天津科潤蔬菜研究所大白菜課題組提供。

1.1.2? 菌株來源。供試菌株自湖北長陽賀家坪的大白菜發(fā)病腫根中采集，該菌經(jīng)Williams方法鑒定為致病性強(qiáng)的4號生理小種[17-18]，菌株取回后洗凈干燥處理，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3? 分子標(biāo)記引物來源。前期試驗開發(fā)了2個與‘12G57中抗根腫病基因CRb連鎖的分子標(biāo)記 Bra0235-2和Bra19317，經(jīng)驗證在抗感雙親‘12G57和‘H227間具有多態(tài)性，可用于各世代的前景選擇。在分布于大白菜基因組的680個SSR標(biāo)記中[19-20]，選擇均勻分布于 10條染色體的140個分子標(biāo)記，通過父母本間的篩選，獲得穩(wěn)定的多態(tài)性標(biāo)記20個可用于各世代的背景選擇，上述引物均由華大基因公司合成。

1.2? 方法

田間試驗主要在天津科潤蔬菜研究所武清基地日光溫室及寶坻露地開展。分子試驗在天津科潤蔬菜研究所分子實驗室開展。

1.2.1? 各世代的前景選擇。

試驗前期對田間定植的36株BC1F1群體進(jìn)行2個連鎖標(biāo)記Bra019235-2和Bra019317的篩選，選出兼具2個標(biāo)記抗病帶型的單株與H227輪回親本回交，得到下一代回交群體，依此多次回交。

分子標(biāo)記篩選試驗中大白菜的DNA采用改良后的堿裂解法提取[21]，并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳（電泳緩沖液為1×TAE）對DNA的提取質(zhì)量進(jìn)行檢測，GelRed染色，在凝膠成像儀上成像、觀察。以10 μL的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色。

1.2.2? 各世代的背景選擇。

選擇均勻分布于10條染色體的140個標(biāo)記，通過父母本間的篩選，得到20個穩(wěn)定的多態(tài)性標(biāo)記用于各世代的‘H227基因組背景選擇。在根腫病連鎖標(biāo)記前景選擇的前提下，從每個世代的抗性雜合單株中選擇‘H227基因組含量高的單株用于回交或自交，直至篩選出抗性基因純合且基因組與‘H227完全相同的個體，即為抗根腫病的‘H227近等基因系。

輪回親本基因組含量= SSR 標(biāo)記位點純合數(shù)/SSR 標(biāo)記總數(shù)×100%

輪回親本基因組含量期望值=（1-1/2r+1）× 100%，式中 r 為回交次數(shù)。

1.2.3? 根腫病人工接種鑒定。

在天津科潤蔬菜研究所武清基地采用密封菌土法進(jìn)行根腫病人工接種鑒定，取自交系‘H227和‘12G57及近等基因系GS2-2、GS2-9、GS2-14、GS4-13的種子各32穴，每穴留苗1株 。苗盤置于溫室通風(fēng)陰涼處，25 ℃條件下生長，避免陽光長時間直曬，苗盤下保持1 cm水層，接種30～ 40 d開始調(diào)查病情指數(shù)。

根腫病病情調(diào)查方法及分級標(biāo)準(zhǔn)參考王彤彤等[19]，PIAO等[22]的描述，分為0～7級，即0級，主根未發(fā)生病害，主、側(cè)根正常，無根瘤;1級，主根未發(fā)生病害，側(cè)根有個別小根瘤;3級，主根出現(xiàn)病害癥狀但腫大不明顯，側(cè)根出現(xiàn)較多根瘤;5級，主根根瘤明顯，主根根瘤直徑為莖基的 2～3 倍，側(cè)根出現(xiàn)許多大的根瘤;7級，主根異常腫大，主根根瘤直徑為莖基的3倍以上，側(cè)根根瘤多而大。

病情指數(shù)=[Σ（各級病株數(shù)×相應(yīng)級別）/（調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高級別代表值）]×100% ，病情指數(shù)<10為抗病（R），病情指數(shù)≥10為感病（S）。

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.4? 近等基因系的農(nóng)藝性狀鑒定。

在寶坻試驗基地對近等基因系和輪回親本H227進(jìn)行表型鑒定，采用隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計，重復(fù)3次，每次重復(fù)36株。收獲期記錄調(diào)查球重、中心柱高、株高、株幅、心葉色、外葉色、葉皺、茸毛、抗病性等農(nóng)藝性狀，并利用DPS軟件分析差異顯著性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 各世代的前景選擇和全基因背景選擇

2.1.1? BC1F1世代。在BC1F1 代36 株個體中，僅進(jìn)行前景選擇，利用分子標(biāo)記Bra0235-2和Bra19317篩選出均表現(xiàn)雜合抗病帶型的 17 株個體（圖1），結(jié)合田間表型選擇結(jié)果，隨機(jī)選擇5株個體與輪回親本進(jìn)行回交，次年獲得 5個株系的BC2F1代種子。

2.1.2? BC2F1世代。

在構(gòu)建BC2F1世代群體時，需要考慮群體數(shù)量的大小與選擇效率間的關(guān)系，過小無法篩選到目標(biāo)性狀單株，過大則加重篩選的工作量。Frisch等[23]就此研究發(fā)現(xiàn)在各世代群體中至少15～20株才能篩選出1個目標(biāo)個體。張騰等[10]則認(rèn)為在白菜基因組中回交群體篩選7株即可獲得2個目標(biāo)個體。該研究為降低工作量及保證單株中選概率，自BC2F1代開始每個株系的群體數(shù)量設(shè)定為18株。

來自5個株系的BC2F1群體（GZ1～GZ5）共90個單株，在其中篩選出雜合抗病單株42株，純合感病單株48株。經(jīng)過對42株雜合抗病單株進(jìn)行分子標(biāo)記背景選擇，獲得17株輪回親本基因組含量高于87.5%的單株，分別與輪回親本回交構(gòu)建BC3F1代。

2.1.3? BC3F1世代。

BC3F1群體（GZ1～GZ17）中共有306個單株，17株田間早期死亡，對289株樣本進(jìn)行前景選擇篩選出雜合抗病單株143株，純合感病單株146株，符合1∶1分離比，再次驗證了兩標(biāo)記的適用性。背景選擇到輪回親本基因組含量高的單株10株，其中基因組含量為95%的6株，90%的4株。中選單株分別與輪回親本回交構(gòu)建BC4F1群體，并選擇基因組含量為95%的6株分別自交構(gòu)建BC3F2代。

2.1.4? BC4F1世代和BC3F2世代。

對回交群體BC4F1進(jìn)行前景選擇獲得雜合單株90株，結(jié)合田間表型選育，每個株系選擇5株進(jìn)行背景選擇，共篩選出9株‘H227基因組含量為100%的單株。對BC3F2群體中前景選擇獲得純合抗性單株19株（表1），進(jìn)一步進(jìn)行背景選擇，得到4株‘H227基因組含量為100%的單株（表2）。

2.2? 根腫病抗性鑒定

課題組前期試驗驗證了12G57材料中抗病性受顯性單基因控制，遵循孟德爾遺傳定律[24]。對高抗病親本材料12G57、高感病親本材料H227以及近等基因系GS2-2、GS2-9、GS2-14、GS4-13接種鑒定，35 d后，依據(jù)病情分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行根腫病抗性鑒定統(tǒng)計（表3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12G57均表現(xiàn)為抗病、H227均表現(xiàn)為感病、4個近等基因系均表現(xiàn)為抗病，苗期接種鑒定結(jié)果與分子篩選結(jié)果一致。

2.3? 近等基因系農(nóng)藝性狀鑒定

以青麻葉優(yōu)良性狀大白菜H227作為對照，對GS2-2、GS2-9、GS2-14、GS4-13這4個近等基因系進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 0.01水平下4個近等基因系與H227在球高、球重、中心柱高、株高、株幅等數(shù)量性狀中差異不顯著（表4），在株型、心葉色、外葉色、葉皺、茸毛、抗病性等質(zhì)量性狀中與輪回親本一致（表4、圖2），說明通過分子輔助育種不僅從分子水平上獲得了輪回基因組100%的近等基因系，數(shù)量、質(zhì)量等主要農(nóng)藝性狀也已與輪回親本一致。

3? 結(jié)論與討論

青麻葉大白菜是天津地區(qū)重要的優(yōu)勢地方種質(zhì)資源，其經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良，堪稱天津人民冬季的“當(dāng)家菜”。但近年云南、河北、山東、重慶、遼寧等多個青麻葉的主栽區(qū)根腫病頻發(fā)，已嚴(yán)重危害青麻葉大白菜的生產(chǎn)，對居民的“菜籃子”造成了一定影響，因此開展抗病育種研究迫在眉睫。但我國開展抗根腫病研究相對較遲，針對具體地方性種質(zhì)資源的研究更存在一定的空白。該試驗以青麻葉優(yōu)良自交系‘H227為輪回親本，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)快速高效地在BC3F2群體中篩選出輪回親本基因組含量為100%的4株純合抗性單株，構(gòu)建一批抗根腫的青麻葉大白菜近等基因系，并分別從抗病性、主要農(nóng)藝性狀等方面進(jìn)行了評價及鑒定。不僅極大地豐富了天津青麻葉大白菜的種質(zhì)資源，也為今后進(jìn)行品種改良及多抗基因聚合研究打下了基礎(chǔ)。

盛浩聞等[25]認(rèn)為在傳統(tǒng)的抗病育種中僅依靠田間表型性狀選擇進(jìn)行單基因轉(zhuǎn)育至少需要回交6代以上才能選育出高質(zhì)量的近等基因系，且大量材料依靠人工選擇極容易受到主觀因素的影響而造成誤差。此外當(dāng)表型性狀非質(zhì)量性狀時，與表型相關(guān)的基因不一定完全通過表型體現(xiàn)，此時也將降低回交轉(zhuǎn)育的效率。該試驗在田間表型選擇的基礎(chǔ)上輔以分子標(biāo)記選擇技術(shù)，將傳統(tǒng)育種技術(shù)與現(xiàn)代育種技術(shù)緊密融合，保證了選擇結(jié)果的準(zhǔn)確性，提高了選擇效率，僅經(jīng)歷3代篩選就獲得了充分恢復(fù)輪回親本基因組含量的個體，進(jìn)一步驗證了Tanksley等[7]的結(jié)論。

抗病鑒定過程中所用菌株來源于湖北長陽賀家坪，研究表明[17-18]該菌為強(qiáng)致病性的4號生理小種，理論上構(gòu)建的抗病品種抗性強(qiáng)，但目前不同地區(qū)根腫菌的生理小種存在不同且復(fù)雜，國際已公布報道的大白菜根腫病抗性的基因也約有9個，因此單一抗病基因只對部分生理小種產(chǎn)生抗性，抗性不全面，且長期種植單一抗性基因的品種易降低抗病性。今后在該試驗基礎(chǔ)上，繼續(xù)依靠分子標(biāo)記技術(shù)將多個近等基因系的優(yōu)良基因聚合，培育具有復(fù)合抗性的大白菜品種意義重大。

參考文獻(xiàn)

[1]田清震，周榮華，賈繼增.小麥抗白粉病近等基因系遺傳背景的分子標(biāo)記檢測[J].作物學(xué)報，2004，30（3）：205-209.

[2]田清震.中國小麥部分種質(zhì)遺傳多樣性分析及小麥抗白粉病分子標(biāo)記輔助選擇研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2002.

[3]張毅，李云峰，謝戎，等.水稻小穗簇生性近等基因系的構(gòu)建及其近等性評價[J].作物學(xué)報，2006，32（3）：397-401.

[4]馬玉銀，左示敏，張在金，等.水稻近等基因系構(gòu)建及其應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（17）：7167-7168.

[5]李希鋒，董娜.小麥近等基因系的構(gòu)建及應(yīng)用進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（5）：2577-2579，2617.

[6]胡云艷.白菜開花相關(guān)基因BrFLCs復(fù)合近等基因系構(gòu)建及FT/TSF基因進(jìn)化分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2015.

[7]TANKSLEY S D，YOUNG N D，PATERSON A H，et al.RFLP mapping in plant breeding： New tools for an old science[J].Bio Technology，1989，7（3）：257-264.

[8]WANG B L，YANG G C，CHEN Z J， et al. Breeding rice resistante to bacterial blight with PCR marker of Xa21 gene[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，2001，20（4）：310-313.

[9]白鵬飛，張世煌，張德貴，等.利用SSR分子標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建QPM近等基因系[J].玉米科學(xué)，2011，19（5）：32-38.

[10]張騰，吳迪，趙卓，等.大白菜抗根腫病近等基因系的選育及其評價[J].分子植物育種，2012，10（6）：722-730.

[11]MATSUMOTO E，YASUI C，OHI M，et al.Linkage analysis of RFLP markers for clubroot resistance and pigmentation in Chinese cabbage （Brassica rapa ssp. pekinensis）[J].Euphytica，1998，104（2）：79-86.

[12]KIM H I，HONG C P，IM S，et al.Development of molecular markers and application for breeding in Chinese cabbage[J]. Korean journal of horticultural science & technology，2014，32（6）：745-752.

[13]張騰，趙卓，張椿雨，等.大白菜抗根腫病基因CRb的精細(xì)定位[C]//中國園藝學(xué)會十字花科蔬菜分會學(xué)術(shù)研討會論文集.北京：中國園藝學(xué)會十字花科蔬菜分會，2012.

[14]楊征，楊曉云，張清霞，等.大白菜抗根腫病基因位點 CRa和 CRb的分子標(biāo)記鑒定[J].華北農(nóng)學(xué)報，2015，30（2）：87-92.

[15]HUANG Z，PENG G，LIU X J，et al.Fine mapping of a clubroot resistance gene in Chinese cabbage using SNP markers identified from bulked segregant RNA sequencing[J].Frontiers in plant science，2017，8：1-9.

[16]張紅.大白菜抗根腫病基因分子標(biāo)記的開發(fā)和定位[D].天津：天津師范大學(xué)，2016.

[17]汪維紅，余陽俊，丁云花，等.湖北省長陽縣十字花科蔬菜根腫病菌生理小種鑒定及抗源篩選[J].中國蔬菜，2013（12）：55-60.

[18]丁云花，簡元才，余陽俊，等.我國8省市十字花科蔬菜根腫病菌生理小種的鑒定[J].中國蔬菜，2013（16）：85-88.

[19]王彤彤，張淑江，章時蕃，等.大白菜根腫病抗性基因的標(biāo)記和定位[J].中國蔬菜，2012（14）：31-35.

[20]王艷.白菜參考遺傳圖譜的構(gòu)建[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

[21]王濤，王超楠，張紅，等.大白菜基因組DNA快速提取方法的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2017，32（6）：67-72.

[22]PIAO Z Y，DENG Y Q，CHOI S R，et al.SCAR and CAPS mapping of CRb，a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage （Brassica rapa ssp.pekinensis）[J].Theoretical & applied genetics，2004，108（8）：1458-1465.

[23]FRISCH M，BOHN M，MELCHINGER A E.Comparison of selection strategies for marker-assisted backcrossing of a gene[J].Crop science，1999，39（5）：1295-1301.

[24]張紅，張斌，聞鳳英，等.大白菜根腫病的遺傳規(guī)律及抗病基因定位研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2017，32（4）：60-66.

[25]盛浩聞，羅麗華，肖應(yīng)輝.水稻近等基因系構(gòu)建及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].作物研究，2014（3）：306-311.