新型冠狀病毒肺炎潛在的發病機制及間充質干細胞治療作用的研究進展

趙亞萍，馬輝，曹潔△

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）致病機制尚不明確，目前主要以對癥支持、抗病毒、氧療、重要臟器維護等治療為主，缺乏特異性治療方法。當前全球抗疫形勢依然嚴峻，尋求新的干預措施，進一步降低死亡率并改善患者預后十分迫切。近年來，大量研究探討了間充質干細胞（MSC）對急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、急性肺損傷等肺部疾病的治療作用并取得進展。MSC憑借其免疫調節、組織修復等特性有望為COVID-19重型患者的治療提供新的臨床思路。本文旨在通過闡述COVID-19潛在的致病機制、MSC對COVID-19治療的可能機制及在治療中的應用，探討MSC治療COVID-19的前景和優勢。

1 新型冠狀病毒潛在的致病機制

全基因組測序分析表明新型冠狀病毒（SARSCoV-2）與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）的核苷酸同源性為79.0%，兩者具有類似的受體結合區域［1］。它在系統發育上最接近蝙蝠SARS樣冠狀病毒，核苷酸同源性為87.6%～87.7%。研究證實，SARS-CoV-2可通過其表面的棘突糖蛋白S蛋白與人體呼吸道上皮細胞的血管緊張素轉換酶2（ACE2）結合，侵染宿主細胞，進行病毒復制、擴增、釋放，同時激活機體的防御反應［2］。ACE2在人體多組織器官均有表達，尤其以肺泡上皮細胞、氣道Club細胞及纖毛細胞為著［3-4］。SARS-CoV-2可攻擊肺臟干祖細胞，損害其再生系統，重型患者或可發展成肺纖維化。因此，SARS-CoV-2感染人體后可引起以肺臟損傷為主的全身多器官損傷，甚至功能衰竭。細胞因子風暴、免疫應答失衡可能是COVID-19導致ARDS及多臟器功能衰竭（MOF）甚至死亡的病生理基礎。

1.1 細胞因子風暴 大部分COVID-19患者臨床癥狀較輕，但仍有部分患者后期病情加重，最終死于ARDS，甚至MOF，其原因與病毒感染過度激活免疫系統致細胞因子風暴及其造成的組織損傷有關［5］。細胞因子風暴是指機體受外界刺激后引起體液中多種細胞因子，如腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1、IL-6、IL-12、干擾素（IFN）-α、IFN-β、IFN-γ、單核細胞趨化因子蛋白（MCP）-1和IL-8等迅速大量產生的現象。Huang等［6］對COVID-19患者的臨床數據分析后發現重型患者易出現細胞因子風暴，重型監護室（ICU）患者血漿IL-2、IL-7、IL-10、粒細胞集落刺激因子（G-CSF），IFN-γ誘導蛋白（IP）-10、MCP-1、巨噬細胞炎性蛋白（MIP）-1A和TNF-α水平高于非ICU患者，這表明細胞因子風暴與疾病嚴重程度有關，是疾病向重型和危重型發展的重要因素。另有研究證實血清TNF-α、IL-6、IL-10可能是SRAS-CoV-2感染疾病嚴重程度的潛在標志物［7］。Chen等［8］報道99例COVID-19患者中17例出現了ARDS，患者病情短期內惡化，推測細胞因子風暴造成了肺毛細血管內皮細胞以及肺泡上皮細胞的彌漫性損傷。然而COVID-19所致細胞因子風暴的機制尚不明確，可能為SRAS-CoV-2感染后迅速激活免疫細胞，產生粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-6等，大量免疫細胞聚集在肺部，啟動瀑布式炎癥級聯反應，釋放大量細胞因子并不斷激活炎性細胞致炎癥風暴，從而造成肺部和其他器官的嚴重免疫損傷［8-10］。

1.2 免疫失衡 淋巴細胞減少是COVID-19患者的常見特征，是與疾病嚴重程度和死亡相關的因素。這種淋巴細胞耗竭的現象主要影響CD4+、CD8+T淋巴細胞，中性粒細胞與淋巴細胞比值（NLR）是判定患者預后的重要因素［11］。研究證實，COVID-19重型患者CD4+T和CD8+T數量顯著減少，且與血清IL-6、IL-10和TNF-α水平呈負相關［7］。隨著患者從前驅階段向明顯癥狀階段發展，T細胞表面衰竭標志物程序性死亡受體（PD）-1和T細胞免疫球蛋白黏蛋白（Tim）-3表達增加，進一步表明T細胞衰竭部分解釋了肺部嚴重的免疫損傷［7］。COVID-19重型患者自然殺傷（NK）細胞亦較輕型患者減少，而B細胞顯著增加［12］。COVID-19患者還可出現以輔助性T細胞17（Th17）增加、CD8+T細胞高細胞毒性為表現的T細胞過度活化，致其處于嚴重免疫紊亂狀態［13］。此外，COVID-19患者雙肺均可見以淋巴細胞為主的間質炎癥細胞浸潤，肺泡腔內出現多核巨細胞和非典型增大的肺泡細胞，與SARS患者相似；其組織學可見彌漫性肺泡損傷和肺透明膜形成等ARDS表現［13］。因此，免疫系統過度激活引起的免疫失衡可能導致COVID-19患者癥狀加重，甚至預后不良。

1.3 肺纖維化 肺纖維化是一種慢性、進行性和破壞性的間質性肺疾病（ILD），以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質沉積、肺組織結構破壞為主要特征。一項薈萃分析顯示14.8%的COVID-19患者可出現ARDS，ARDS早期即可出現膠原蛋白、促纖維化因子水平增加，以及成纖維細胞遷移、增殖和膠原沉積［14］。在ARDS進程中，經典激活的巨噬細胞（M1）和替代激活的巨噬細胞（M2）之間的轉化可能是引起肺部炎癥損傷和纖維化的重要原因［15］。T淋巴細胞中Th1/Th2平衡處于高水平的平衡狀態或偏向Th2，會導致免疫球蛋白過度沉積、成纖維細胞合成膠原蛋白增加，發生肺纖維化的風險也隨之增加。在重型COVID-19患者血清中可以觀察到Th1和Th2型細胞因子水平均顯著提高［16］。因此，Th2型細胞因子促進纖維化的不良反應得到明顯加強，重型COVID-19患者肺纖維化風險明顯增高。血清涎液化糖鏈抗原（KL-6）在ILD早期診斷、病變程度及疾病的預后評價中具有重要價值。KL-6作為重型COVID-19的新型潛在標志物，在重型患者中顯著升高［17］。

2 MSC治療COVID-19的可能機制

MSC屬成體干細胞，是一類具有多分化潛能及自我復制能力的早期未分化細胞。它來源廣泛、易于分離培養和導入，并可表達外源基因，不涉及倫理道德問題，更適合大規模推廣應用。MSC憑借其免疫調節、抗炎、組織修復等特性在COVID-19重型患者的救治中初顯成效，有望成為新型治療方案。

2.1 免疫調節作用 機體免疫應答異常是導致COVID-19患者病情加重的重要因素。MSC具有強大的調節炎癥反應功能，對固有免疫和適應性免疫的多種效應細胞具有顯著的免疫調節作用。MSC主要通過旁分泌機制分泌多種類型的細胞因子或與免疫細胞間相互作用介導調節免疫反應平衡。

研究發現，MSC可以抑制CD4+、CD8+T細胞增殖，其表面表達的PD-1、半乳糖凝集素（Gal）-9等多種免疫抑制分子可與T細胞表面的相應受體結合，抑制T細胞過度活化［18］。不僅如此，MSC也可抑制異常激活的Th1和Th17細胞分化，誘導Th17細胞向調節性T細胞分化，進而減少促炎因子IFN-γ的釋放，上調Th2以促進抗炎因子IL-4的釋放，進而抑制免疫系統過度活化，預防細胞因子風暴的發生［19］。MSC還能抑制B細胞增殖，誘導配對盒基因5（PAX5）蛋白生成，下調B細胞中轉錄因子成熟蛋白（Blimp）-1 mRNA表達，阻止其向漿細胞分化，降低B細胞抗體分泌水平，并抑制B細胞向淋巴結趨化，調節免疫狀態［19］。巨噬細胞是固有免疫中最為關鍵的細胞之一，MSC既可以通過加強巨噬細胞氧化磷酸化來促進M2型巨噬細胞的表達，又能通過細胞外介導的囊泡轉移自身的線粒體到巨噬細胞中以增強抗炎及吞噬能力。NK細胞是顆粒細胞毒性免疫細胞，MSC可抑制活化的NK細胞的細胞毒作用以及NK細胞增殖和細胞因子分泌，也可通過降低活化標志物的表達改變NK細胞表型，改善免疫狀態［20］。MSC還能抑制單核細胞向樹突細胞（DC）分化，干預DC成熟和抗原提呈功能，減少DC激活和炎性因子分泌，進一步發揮免疫抑制功能［19］。

2.2 組織修復及抗纖維化作用 MSC能遷移至受損的組織，主要通過旁分泌作用向受損組織周圍釋放細胞因子、生長因子和囊泡（如外泌體），刺激原始組織細胞進行修復及組織功能特性恢復。MSC可分泌血管生成素、角質細胞生長因子（KGF）、肝細胞生長因子（HGF）等改善肺部微環境，修復肺泡上皮細胞和血管內皮細胞，促進肺泡Ⅱ型上皮細胞釋放表面活性物質，恢復肺組織的通透性［21］；亦可以在局部分泌血管內皮生長因子（VEGF），與HGF產生協同作用，起到肺組織修復和血管重建的作用，增強肺泡-上皮屏障的修復［22］。除了移植MSC本身，MSC外泌體同樣具有組織修復、抗炎和免疫調節等功能。研究發現，MSC外泌體攜帶的KGF能夠減少炎癥因子釋放和肺泡內蛋白滲出并減輕肺水腫，保護內毒素誘導的急性肺損傷［23］。此外，MSC可減少轉化生長因子（TGF）-β、血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子-1等纖維化生長因子生成，降低基質沉積和纖維增生，減輕纖維化的程度［24］。在動物實驗中，MSC可減少PM2.5誘導的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡和壞死，有效改善肺損傷和肺部纖維化［25］。

3 MSC對COVID-19及肺纖維化的治療

截至2020年5月，在Clinical Trials.gov上注冊的MSC治療肺部疾病的臨床研究共68項，其中包括COVID-19、ARDS、特發性肺纖維化等疾?。?6］。ARDS是導致重型COVID-19患者死亡的重要因素。國內已有研究人員將MSC治療用于H7N9禽流感導致的ARDS患者，顯示其具有良好的治療效果［27］。一項系統綜述評估了MSC對ARDS的治療潛能，發現MSC可以顯著改善ARDS患者肺功能、減輕其炎癥反應并降低病死率；輸注MSC后的患者無或僅有輕微的輸入性毒性反應，證實了該療法的安全性和有效性，為臨床應用MSC治療COVID-19重型患者奠定了良好的基礎［28］。

目前大部分臨床試驗尚處于初期階段，僅有個別試驗公布了相關數據。有文獻報道采用人臍帶間充質干細胞（HUCMSC）對COVID-19危重型患者進行治療，該患者在抗生素和胸腺素α1輔助治療基礎上，經3次MSC靜脈回輸治療后病情得到了極大的改善，白細胞、中性粒細胞和淋巴細胞計數均恢復到正常水平，CD3+、CD4+、CD8+T細胞計數也恢復到正常水平［29］。由此可提示HUCMSC治療或可成為救治COVID-19危重型患者的理想臨床方案之一，并且與其他免疫調節劑聯合使用可增強療效。Leng等［30］研究顯示，COVID-19患者在接受MSC治療后，其肺功能和癥狀明顯改善，治療6 d后過度活化的趨化因子受體3（CXCR3）+CD4+T細胞、CXCR3+CD8+T細胞和CXCR3+NK細胞幾乎消失，CD14+CD11c+CD11bmid調節性樹突狀細胞群數量顯著增加，血清TNF-α水平顯著降低，IL-10水平升高，表明MSC具有顯著的免疫調節功能，可有效減輕肺部炎癥反應。Sengupta等［31］發現MSC外泌體亦可明顯改善COVID-19患者的臨床癥狀和氧合狀態，恢復中性粒細胞和總淋巴細胞計數，顯著增加CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞計數，降低C反應蛋白、鐵蛋白、D-二聚體水平。

此外，MSC能有效改善胺碘酮誘導的大鼠肺纖維化及肺部損傷，通過抑制核因子（NF）-κB信號通路，阻斷肺部促炎因子表達，減低肺部炎癥水平，并最終逆轉纖維化進程［32］。一項在人體內高累積劑量干細胞治療特發性肺纖維化伴肺功能快速下降的臨床研究顯示，MSC能夠有效遏制特發性肺纖維化的快速進展，且安全性評估未發現治療相關的顯著不良反應事件［33］。圣保羅州立大學研究團隊前期研究發現，脂肪來源的MSC及其分泌組的條件培養基能夠減輕博來霉素誘導的小鼠肺損傷，由此他們認為MSC條件培養基或許可以作為COVID-19重型患者的替代治療方法［34］。

4 總結與展望

目前COVID-19的確切發病機制尚不明確，缺乏特異性治療方案?，F有研究表明COVID-19患者病情加重或死亡與機體免疫系統過度激活誘導的細胞因子風暴密切相關。MSC憑借其免疫調節、抗炎作用、組織修復等特性在COVID-19重型患者的救治中初顯療效，有望成為重型患者同情用藥治療后不可行情況下的替代方案。但是，目前多數治療缺乏動物實驗依據及合適的臨床對照試驗，最佳MSC來源和劑量、給藥時間窗、給藥途徑和頻率尚不十分清楚，仍需要嚴謹的科學態度推進臨床試驗進展及更多數據的進一步反饋，從而優化治療方案。