柑橘枯水研究進展

姚世響，李秋雨，曹琦，鄧麗莉，曾凱芳*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(西南大學食品貯藏與物流研究中心，重慶，400715)

柑橘富含可溶性糖、檸檬酸和抗壞血酸等營養及生理活性物質，風味口感俱佳，深受消費者喜愛，迄今已有四千多年的栽培歷史[1]。中國是柑橘原產地之一，國家統計局數據顯示2018年柑橘的栽培面積和產量超過3 730萬畝和4 138萬t，均位居世界首位。枯水常發生于柑橘采前和采后貯藏階段，是柑橘果實的重要生理性病害[2-5]。

柑橘枯水時表現為水分干枯、糖酸風味寡淡、汁胞硬化、嚴重時喪失食用價值[2, 4-5]。劉基《賣桔者言》中“金玉其外、敗絮其中”是對柑橘枯水最早的文字描述，即柑橘經長期貯藏后，盡管果皮正常新鮮，但果肉已經干枯絮敗。柑橘枯水，又稱粒化，自1934年以來陸續有國內外學者關注和研究[4, 6-7]。本課題組在多年研究柑橘枯水的基礎上，對相關進展進行系統論述，旨在為柑橘枯水研究及防控措施開發提供借鑒。

1 枯水對柑橘產業的影響

我國柑橘大多數品種在10～12月成熟，短時間集中上市不僅給銷售帶來很大困難，同時也影響水果的穩定供給。柑橘產業通過采后貯藏和拓寬果實成熟時間(發展早、晚熟品種)等2種主要策略緩解銷售壓力，保障柑橘消費市場周年供給。例如，長江中上游柑橘帶大力發展晚熟柑橘，成熟期可延長至次年1～3月，輔以留樹保鮮技術能進一步延長至5月上市；再加上部分早熟品種，基本可以實現柑橘鮮果的全年供應。柑橘長期貯藏和留樹保鮮階段易發枯水，某些品種表現得尤為嚴重，如臍橙(紐荷爾臍橙、奉節晚橙、倫晚臍橙、夏橙、鮑威爾臍橙)、寬皮柑橘(椪柑)、晚熟雜柑(W.默科特、不知火、甘平)和蜜柚[4-5,7]。

枯水降低了柑橘品質和果實商品價值，制約了柑橘的有效供給，讓柑橘產業難以滿足中國消費結構轉型下老百姓對柑橘“吃得好”的需求。目前缺乏柑橘枯水的系統調查數據，按照全國柑橘的枯水發生率為1%(一些品種發生率遠高于此)計算，受枯水影響的柑橘果實量高達41.4萬t/年，產值約16億元/年。枯水已經成為制約柑橘產業發展的重要因素。

2 柑橘枯水與果實品質劣變

2.1 水分

柑橘枯水得名于果實食用時水分干枯，但水分減少其實并不是枯水的主要特征[8]。數據表明柑橘枯水時，汁胞相對水分含量變化并不明顯，甚至呈增加趨勢[3-4, 9]。水分較少的食用口感可能是因為水分在枯水進程中參與汁胞凝膠形成，被束縛住，導致自由水含量大幅減少，表現為出汁率顯著下降[10]。果實的水分干枯口感還與果實失重有關。部分柑橘枯水時，果實沒有顯著失重[11]；部分柑橘枯水時，果實失重非常顯著，如椪柑和沙田柚嚴重枯水時失重率分別為正常果實的5倍和2倍[8-9]。果實質量大幅降低意味著大量水分散失，呈現為果實水分較少的食用品質。

2.2 營養和生理活性物質

柑橘果實的主要營養物質是可溶性糖和有機酸，其中可溶性糖主要為蔗糖、葡萄糖和果糖3種組分，有機酸主要為檸檬酸，還有少量蘋果酸[3, 12]。柑橘枯水的主要特征是營養風味驟然劣變，這與柑橘采后貯藏衰老階段果實風味緩慢劣變有明顯不同。數據表明柑橘枯水時，可溶性糖和有機酸快速消耗，最低可降低至正常汁胞的25%～30%[3-5, 7-9, 13]；其中，蔗糖，葡萄糖和果糖含量均出現顯著降低[3-4, 7]；檸檬酸含量顯著降低，蘋果酸在椪柑中降低，在臍橙和蜜柚中升高[3-4, 7]。正是這些可溶性糖和有機酸主要組分在枯水時急劇降低，導致了柑橘果實的營養風味急劇劣變。

果實風味還與香氣密切相關，香氣由揮發性物質決定，柑橘揮發性物質中含量最多的是萜烯類物質，其中主要成分是D-檸檬烯[14-15]。椪柑果實枯水時揮發性物質總含量下降了68%，其中D-檸檬烯含量減少了87%[16]；臍橙枯水時揮發性物質總含量降低了46%，其中D-檸檬烯降低了85%[4]。

柑橘果實富含大量類胡蘿卜素、抗壞血酸、多酚等生理活性物質，在枯水時含量普遍下降。枯水汁胞發白，橙色消失，類胡蘿卜素顯著消耗[17]；抗壞血酸含量在枯水時顯著下降，最高約50%[4-5]；多酚含量在枯水時下降超過一半[5]。

2.3 質地

質地是柑橘果實的重要品質，主要由細胞壁決定[18]。與柑橘成熟后期的汁胞化渣不同，果實枯水時汁胞粒化、變硬、難以咀嚼，這也是柑橘枯水的另一典型特征，這種質地變化的生物學基礎是細胞壁組分發生了改變[2-3, 18]。果膠是細胞壁中膠層主要組分，起粘連相鄰細胞功能，成熟過程中果膠降解，導致細胞松散，宏觀上表現為果實質地變軟，呈化渣特性[19]；枯水過程中，果膠結構與含量發生了變化，可能與水分子、鈣離子交聯形成凝膠，進一步增強細胞間粘連，是汁胞硬化的重要因素[4]。木質素是細胞壁的次生壁的主要成分，在增強細胞機械強度方面有重要功能[20]。柑橘枯水時，汁胞木質素含量增加，有明顯次生壁發育現象，細胞壁加厚，特別是在緊皮柑橘如橙類和柚類果實中較為顯著，這是導致枯水汁胞顯著變硬，難以咀嚼的主要原因[4, 17, 21]。

3 柑橘枯水時果實品質劣變的生物學基礎

3.1 糖酸代謝途徑

可溶性糖和有機酸是柑橘果實核心營養物質，在貯藏衰老階段中緩慢消耗，但在枯水進程中呈快速耗竭特征[3, 22]。柑橘采后衰老階段糖酸消耗機制可參考本課題組最近發表的綜述[3, 22]。柑橘可溶性糖可通過蔗糖和單糖代謝途徑及呼吸途徑降解，也可以轉運至果皮參與代謝[23]。柑橘果實生長初期開始合成有機酸，發育和成熟后期至貯藏階段逐漸降解[24]。其中，柑橘有機酸主要組分檸檬酸的降解主要有4條途徑，包括三羧酸循環、合成γ-氨基丁酸、合成谷氨酰胺及其他氨基酸、合成乙酰輔酶A及次生代謝物[24-27]。

柑橘枯水時糖酸物質急劇消耗與呼吸途徑有關。柑橘是非呼吸躍變型果實，呼吸強度在采后貯藏階段逐漸降低，但在枯水發生進程中會升高，枯水果實的呼吸強度可高至正常果實的1.5～6倍[5, 28]。三羧酸循環以檸檬酸為底物，參與呼吸途徑，其中順烏頭酸酶(aconitase，Aco)是關鍵酶，將檸檬酸催化為異檸檬酸[29]。椪柑和柚類枯水汁胞中，Aco編碼基因表達量顯著上調，顯示三羧酸循環參與了柑橘枯水時的檸檬酸降解[3, 7]。綜上，活性增強的呼吸途徑是枯水汁胞糖酸物質耗竭的重要途徑。

呼吸作用可以為細胞壁代謝途徑提供反應所需能量和細胞壁組分合成所需前體。考慮到柑橘枯水時汁胞的2個典型特征是糖酸物質快速消耗和細胞壁物質含量增加，有學者基于葡萄柚和柚類生理數據提出假設，認為細胞壁組分合成可能是誘發柑橘糖酸風味劣變的關鍵因素[28, 30]。本課題組發現椪柑果實糖酸物質的分布具有異質性特點，即糖酸物質分布不均一，濃度沿果蒂至果頂逐漸升高；同時，枯水通常偏好從糖酸物質濃度最低的果蒂開始發生，暗示枯水發生與糖酸代謝存在緊密關聯；運用二代核酸測序技術和代謝組學技術對采后枯水過程中椪柑不同部位汁胞進行系統比較，首次從組學層面解析柑橘枯水時營養物質劣變的代謝途徑[3]。結果表明椪柑采后枯水進程中蔗糖合成途徑被抑制，包括蔗糖和單糖在內的糖降解途徑和呼吸途徑被激活，細胞壁物質(包括果膠、纖維素和木質素)降解途徑被抑制，細胞壁合成途徑被激活；同時糖酸組分(蔗糖、葡萄糖、果糖、檸檬酸和蘋果酸)含量下降，細胞壁組分(纖維素、原果膠、木質素)含量增加[3]。綜合分析椪柑枯水結果可以發現，細胞壁合成途徑可能是誘導柑橘果實糖酸物質耗竭的關鍵代謝途徑。類似結果在臍橙采后枯水中也存在[4]，在低溫誘導晚熟臍橙采前枯水的研究中得到了進一步證實[31]。

3.2 細胞壁合成途徑

柑橘果實成熟時細胞壁降解，細胞壁組分含量降低，而枯水時細胞壁組分含量升高，顯示細胞壁代謝途徑有重大差異。柑橘枯水時，果膠合成途徑關鍵基因UDP-葡萄糖醛酸-差向異構酶編碼基因和半乳糖醛酸轉移酶編碼基因表達量升高，果膠降解關鍵基因，如果膠甲酯酶(pectin methylesterase, PME)編碼基因表達量降低[3]。PME活性在枯水時的變化比較復雜，臍橙粒化突變體和正常果實相比PME活性降低[32]；晚熟臍橙枯水時PME活性升高[31]；這需要我們謹慎審視PME在柑橘枯水中的功能。果膠含量在枯水時通常不會降低，反而升高[31]。纖維素合成酶編碼基因表達量升高，有利于初生壁主要組分纖維素含量增加[3]。另外，柑橘枯水時，木質素合成途徑關鍵基因，如肉桂醇脫氫酶基因表達量顯著上調[3, 31]。枯水汁胞木質素含量顯著增加[3-4, 21, 30]；枯水汁胞中能觀察到明顯次生壁發育，細胞壁顯著加厚[3, 21, 34-35]。

次生壁發育不僅存在于汁胞枯水進程中，更是維管植物普遍存在且調控機制相對保守的生物學現象[20, 36]。目前研究表明以NAC-MYB轉錄因子為核心所介導的轉錄調控網絡在次生壁發育中起關鍵作用[36-37]。本課題組運用轉錄組學技術鑒定到椪柑枯水特異性NAC和MYB轉錄因子各2個[3]。對臍橙枯水相關MYB轉錄因子進行異源功能分析，發現其具有調控次生壁合成功能，未來可望進一步探討其在柑橘枯水進程中的功能[38-39]。

3.3 果皮結構

柑橘果實是包含果皮和果肉的有機整體，其中果皮與果實品質、貯藏特性存在密切關系[22]。目前果皮與果實枯水關系比較復雜，尚無統一結論。一方面，果皮發育不好或者早衰都可能促進柑橘枯水。果皮蠟質發育不好，果實保水能力顯著降低，在發育及成熟過程中易失水，最后可能促進柑橘枯水[40-41]。20世紀80～90年代龐杰等[42]、張百超等[43]對寬皮柑橘枯水開展了系列研究，發現果實貯藏過程中，果皮早衰導致果皮結構疏松，促進果實整體代謝加強，最終誘發枯水。另一方面，有證據顯示為了維持果皮正常生理活動，果肉中大量營養物質和水分被轉運至果皮，進而誘發了果肉枯水。寬皮柑橘果皮與果肉之間有相對發達的維管組織作為輸導系統，在果肉與果皮間轉運營養物質和水分，因此在長期貯藏過程中，果肉營養物質與水分容易運輸至果皮，以幫助果皮適應逆境，極端情況便是果皮正常而果肉枯水，即所謂“金玉其外，敗絮其中”[22]。有證據支持柑橘采后貯藏階段，果皮存在的二次生長驅動營養物質從果肉轉運至果皮被消耗，進而誘發枯水[44-45]。目前果皮與果肉枯水關系還有很多疑問，比如很難確定究竟是果皮衰老還是果皮生長在促進果實枯水。

4 柑橘枯水防控技術

4.1 采前因素與柑橘枯水關系

柑橘枯水與采前因素密切相關，包括樹齡、結果數量、果實大小和果皮結構。樹齡比較大的樹，果實發生枯水的風險較高[46]。單樹結果少，容易導致單果大，果皮徒長而結構粗糙，容易枯水，因此將每棵樹的掛果數量控制在合理范圍對于預防柑橘枯水非常重要[47]。對于有種子的柑橘品種，汁胞雖面臨種子競爭營養，卻更不易枯水，如琯溪蜜柚雜交品種，有籽果實枯水率要遠低于無籽果實[48]。砧木對樹體抗逆性、營養吸收能力和果實品質有重要影響，也能一定程度影響柑橘枯水。

有效的栽培管理能緩解柑橘枯水。采前過量灌溉會導致柑橘枯水，因此在生產中減少單次灌溉水量和灌溉次數可有效減緩枯水發生[8]。其機理可能是土壤適當干旱有利于促進樹體脫落酸合成，進而誘發果實表面蠟質合成，增強果實保水能力[40]。柑橘果實如果掛樹時間較長，留樹期間果蒂處易枯水，采收期較晚，果實不耐貯藏且易枯水，因此適當早采有利于減緩枯水[8]。

礦質元素處理能緩解枯水發生。在柑橘果樹生長季節聯合噴施ZnSO4和CuSO4可將枯水發生率由78%降至51%，噴H3BO3也有類似效果[50]。對晚熟柑橘采前合理噴施K、Zn等礦質元素，也能一定程度緩解越冬果實枯水[51]。植物激素作為調控果實成熟與衰老的關鍵因子，目前在枯水中的確切功能還知之甚少。

4.2 采后控制技術與措施

研究顯示目前有一些采后措施，如預貯處理、植物激素浸泡和礦質元素處理，能夠緩解柑橘枯水。果實采后預貯處理對果實的貯藏性能和品質提升具有明顯作用。對柑橘進行預貯處理后，可顯著降低果皮含水量，抑制果皮生理活性，能有效延緩果皮生長，能降低枯水的發生率[8]。赤霉素GA3浸泡處理能夠一定程度抑制椪柑、蕉柑、紅桔枯水的發生[8]。采用鈣離子浸泡可減緩胡柚枯水[44]。總的來說，柑橘產業目前還比較缺乏對于柑橘采后枯水的高效防控措施。

5 總結與展望

5.1 存在問題

柑橘枯水研究存在的第一個主要問題是不同研究結果難以統一。對于生理數據：失重率、相對含水量和果膠含量等，在枯水時可能升高或者變化不顯著；呼吸強度和PME活性等，在枯水時可能升高或者降低。對于果皮數據：既有支持營養物質可從果肉轉運至果皮的證據，也有不支持的證據；既有支持采后果皮二次生長誘導果肉枯水的證據，也有支持采后果皮衰老誘導果肉枯水的證據。不同實驗室結果的相互矛盾使得枯水研究難以深入，這很大程度上源于柑橘枯水的復雜性。從我們的研究來看，枯水是一個復雜現象的統稱。從柑橘種類和發生條件來看，不同種類柑橘的枯水表型不同，比如寬皮柑橘和緊皮柑橘的粒化汁胞在質地方面存在明顯差異；同一品種柑橘因為不同誘發因素所發生的枯水，表型也不一致，比如低溫誘導和采后貯藏誘導的粒化汁胞表型有明顯差異；同一品種相同條件下也會有不同枯水類型，如蜜柚采后既有裂瓣型枯水，也有非裂瓣型枯水，這兩類粒化汁胞表型有差別。從枯水(粒化)汁胞表型看，枯水汁胞至少包括膨大型和萎縮型等多種。從汁胞生理狀態看，從正常狀態發展到木質化狀態，至少有3個階段，包括膨大、凝膠化和木質化。

柑橘枯水研究的第二個主要問題是盡管目前發現了很多與枯水發生密切相關的因素，但卻難以控制實驗條件，證實這些因素對柑橘枯水有誘發作用，這與枯水是采前和采后因素綜合決定有關。因此，學術界迄今為止未能建立可穩定誘導柑橘枯水研究的模型，這使得許多枯水研究局限于基于分析正常和枯水汁胞的差異而得出的結果，難以通過實驗體系進行快速有效驗證，即很多實驗結果停留在相關性層次的水平，難以確立其與枯水的因果關系。

5.2 研究展望

建立合適的柑橘枯水研究體系，是枯水研究的關鍵前提。考慮到枯水作為一種復雜生理現象，含有多種汁胞類型，為了獲得易重復且可信度高的結果，在實驗材料上應盡可能降低樣品復雜度，比如，可以考慮將汁胞從正常狀態演變到木質化狀態的各個中間狀態進行精準區分，以此為一個研究體系。

其次是明確并界定柑橘枯水所包含的科學問題，如失水、凝膠化、木質化、低溫脅迫等。在明確科學問題后，再借鑒模式植物的研究進展，綜合運用組學技術(轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學)、植物分子生物學技術、生物化學和細胞生物學技術對枯水機制展開研究。