甲殼素/殼聚糖的分離提取方法及在食品工業中的應用研究現狀

袁媛，榮雅利，楊豐，陳露珠，施文正,2，汪之和*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(國家淡水水產品加工技術研發分中心，上海，201306)

隨著我國養殖、捕撈技術的進步，我國水產加工業飛速發展，同時也導致水產品加工廢棄物激增。然而，這些廢棄物中往往含有可利用的高價值物質，包括蛋白質、礦物質，ω-3不飽和脂肪酸、甲殼素、蝦青素和其他生物活性物質等[1]，其中甲殼素(chitin)是迄今為止僅次于纖維素的第二大可再生天然聚合物，每年的生物合成量約為100億t[2]。甲殼素資源豐富并具有許多特殊的生物理化性質，被認為是可替代石油的生物燃料和其他功能性化合物的生物質來源[3]。作為二十一世紀環境友好型的新型生物高分子材料，甲殼素具有廣闊的應用前景和較高的商業價值。

甲殼素學名為(1,4)-2-乙酰胺-2-脫氧-β-D葡聚糖，相對分子質量從幾十萬到幾百萬，在自然界中廣泛存在于具殼海洋生物的外殼中[4-5]。甲殼素無毒、可降解，且具有良好的生物相容性，不易引起受體的免疫反應，在醫療方面應用前景廣闊。但由于甲殼素疏水性較強，僅溶于氟醇(六氟異丙醇、六氟丙酮等)、堿性冰水混合物等特定溶劑中[3]，應用范圍受到很大限制，其經濟價值長期未能得到應有體現；殼聚糖(Chitosan)學名為(1,4)-2-氨基-2-脫氧-β-D葡聚糖，相對分子質量從數十萬至數百萬不等[6]，是甲殼素N-脫乙酰基的產物，可溶于大部分稀酸中，一般脫乙酰化程度大于50.0% 的甲殼素就被認為是殼聚糖[7]。殼聚糖的氨基上可以連接各種不同的活性基團而表現具有不同的生物活性功能[8]，如抗菌性、吸濕性、生物相容性和吸附性等[9-10]，可用于食品、醫藥、農業、日化產業以及水處理等領域，尤其是在食品抗菌、包裝、添加劑等方面應用較多[11]。

1 甲殼素研究

1.1 甲殼素的來源和類型

甲殼素由BRACONNOT教授于1811年在蘑菇中首次發現；1823年，ODIER在昆蟲的外殼中再次發現同種物質，并命名為Chitin；1859年，ROUGHET發現甲殼素經過化學處理后可以轉化為水溶性形式；1870年之后，這種改性甲殼素被命名為殼聚糖[12]。一百多年來，越來越多的生物中被發現含有甲殼素，甲殼素的含量可隨生物種類和季節變化而變化[8]。干重條件下，不同生物體甲殼素含量(外殼、菌絲體、軟骨等中)見表1。

甲殼素是長鏈高分子化合物，分子結構見圖1-a，由于鏈的規整性和分子剛性較大，易形成分子內氫鍵和分子間氫鍵，有利于晶態的形成和轉化成新的衍生物[3]。如圖1-b，甲殼素根據分子鏈排列方式的不同可分為α、β、γ(從左往右)3種不同的類型。其中α-構型甲殼素最為常見，存在于節肢動物和真菌細胞壁中；β-甲殼素多見于軟體動物(如魷魚、章魚)軟骨中，對溶劑有更高的親和力[17]；γ-甲殼素比較少見，存在于成年蝗蟲、蟑螂、螳螂等昆蟲中[18]。α-甲殼素分子結構緊密，通過氫鍵牢牢地固定在一起，呈片層狀；β-甲殼素具有較低的層間氫鍵，易發生膨脹和滲透。

表1 不同來源生物體的甲殼素含量Table 1 Chitin content of organisms from different sources

a-甲殼素分子結構;b-甲殼素分子鏈的3種排列方式圖1 甲殼素分子結構及不同構型甲殼素的分子鏈排列方式Fig.1 Molecular structure of chitin and arrangement of molecular chains of chitin with different configurations

1.2 甲殼素的分離提取方法

我國目前工業生產甲殼素/殼聚糖的主要原料是水產品加工中廢棄的蝦蟹殼，其中含有約30%～40%的蛋白質、30%～50%的礦物鹽(主要是CaCO3)和20%～30%的甲殼素及少量色素(如蝦青素)和脂類，提取甲殼素的關鍵就是去除其中的CaCO3和蛋白質等主要物質[10]。目前甲殼素的提取方法主要有化學法和生物法[19]，近年來各種綠色簡單的新方法也在不斷地被開發。

1.2.1 化學法提取甲殼素

化學法又稱酸堿法，是提取甲殼素的傳統方法，也是當前產業化法提取的主要方法。化學法包括“三脫”，即脫礦、脫蛋白和脫色，常用酸脫礦、堿脫蛋白、有機溶劑或氧化劑脫色，有時也會通過物理超聲或微波輔助優化提取率。李曄等[20]通過超聲間歇酸堿法，減少了酸堿使用量，提取物產率為19.6%；藍尉冰等[21]采用微波消解輔助制備甲殼素，改善了南美白對蝦中甲殼素提取的得率和工藝周期。化學法雖然簡單高效，但會產生大量的酸堿廢液，并且蛋白質、礦物質等有效成分經酸堿處理后無法回收，越來越多的學者嘗試開發新的提取方法。

1.2.2 生物法提取甲殼素

未名湖上，黃龍旗航模艦隊和太陽旗航模艦隊又戰成了一團，不過這次戰斗的操作方，分別是清華附小和北大附小的同學們……

生物法的原理是利用一些細菌和真菌發酵體產生的有機酸或蛋白酶來去除蛋白質和鈣鹽，從而達到制取甲殼素的目的，與化學法的比較見圖2。用于發酵提取甲殼素的微生物主要有芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、沙雷氏菌屬、嗜熱鏈球菌等，其中乳桿菌屬研究最多。李麗等[22]以蟹肉罐頭下腳料為原料，在自然pH條件下篩選出較優的蛋白酶酶解脫蛋白，再通過檸檬酸脫鈣、H2O2脫色，制得甲殼素得率13.71%；LIU等[23]用鼠李糖乳桿菌和淀粉芽孢桿菌連續兩步發酵法從對蝦蝦殼中提取甲殼素，保持了與市售甲殼素相似的理化和結構特性。生物法提取的甲殼素具有較高的營養價值，可作為動物飼料甚至營養保健品；但是該方法耗時長、成本較貴，與化學法的優缺點比較見表2。

圖2 化學法和生物法提取甲殼素的工藝流程Fig.2 technological process of chitin extraction by chemical and biological methods

國內外也有許多學者采用酶法和化學法相結合的新思路來制備甲殼素，條件溫和，不僅解決了污染問題，而且其中的蛋白與鈣鹽也得到了回收利用，段元斐等[24]以螃蟹殼為原料，采用復合酶降解蛋白、有機酸脫鈣、乙醇脫色制取食品級甲殼素，并循環利用檸檬酸脫鈣后的廢液，制取檸檬酸鈣晶體；YOUNES等[25]用1.5 mol/L的稀HCl溶液脫礦，再用Bromelain和Alcalase兩種商業蛋白酶在60 ℃酶解實現蝦殼廢料脫蛋白，得到純度較高的甲殼素。

1.2.3 其他提取甲殼素的新型方法

近幾年來，針對甲殼素的提取，國內外許多學者嘗試使用其他新型綠色方法制備高品質甲殼素，以減少傳統化學法帶來的環境污染和生物法工藝周期長的問題。

表2 化學法和生物法提取甲殼素的比較Table 2 Comparison of chitin extraction by chemical method and biological method

(1)乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)輔助法：EDTA是一種優良的金屬螯合劑(如Ca2+、Mg2+)，可代替酸脫礦并且對甲殼素分子鏈的影響較小。王婷[26]利用EDTA螯合劑代替酸去除礦物質，制得克氏原螯蝦甲殼素的提取率為20%，高于生物發酵法。

(2)電解水法：電解水法的原理是通過電解稀鹽(通常是NaCl)溶液產生酸性和堿性電解液代替傳統工藝中使用的HCl和NaOH提取甲殼素，與傳統工藝相比，電解水法產品品質更高，污染更小。韓曉梅等[27]采用乳酸與堿性電解水聯合處理脫除蟹殼中的礦物質與蛋白質，制備乳酸鈣和甲殼素，大大減少了酸堿使用量。

(3)離子液體(ionic liquids，IL)法：離子液體是一種由有機陽離子和有機或無機陰離子組成的低溫熔融鹽，在適當溫度和時間條件下能夠溶解礦物質、蛋白質和甲殼素，再在混合體系加入反溶劑(如H2O)沉淀甲殼素，其他物質則從離子液體廢液中被脫除，提取溫度、時間和離子液體種類對甲殼素得率有很大影響[28]。LETA等[29]使用多種銨基離子液體(乙酸二異丙基乙基銨、丙酸二異丙基乙基銨和乙酸二甲基丁銨)在110 ℃下反應24 h提取甲殼素，得率可達13.4%。

(4)低共熔溶劑(deep eutectic solvent,DES)法：DES是一種由氫鍵供體(如多元醇、尿素和羧酸等)和氫鍵受體(如氯化膽堿等)形成的二元/三元體系的共晶溶劑[30]，作為一種與IL性質類似、但毒性和成本更低的新型綠色溶劑，可替代IL用于甲殼素等天然有機成分的分離提取。SARAVANA等[31]利用不同類型的DES從蝦殼中提取甲殼素并制成膜，發現用DES-8(氯化膽堿丙二酸)合成的甲殼素得率最高，達19.41%，并且DES膜的力學、溶脹和生物降解性能與標準膜相似。

以上新型方法旨在提高甲殼素產品質量、減少提取周期和環境污染，但仍存在不少弊端限制了其工業化大規模生產。其中EDTA輔助法的一次性投資較大；電解水法得率較低且較耗時；IL法的產品安全性并未得到求證、成本較高；DES法的溶劑黏度較高、操作困難，且得到甲殼素的熱穩定性不及傳統法[30,32]。基于以上弊端，以上新型方法僅限于實驗室規模研究。

2 殼聚糖研究

2.1 殼聚糖的結構與性質

殼聚糖是甲殼素經脫乙酰化的產物，是接合菌細胞壁的重要組分，也存在于擔子菌、子囊菌和藻菌綱的菌絲體、莖稈和孢子中[33]。殼聚糖分子基本結構如圖3，也可分為 α、β、γ 3個構型。

圖3 殼聚糖的分子結構圖Fig.3 Molecular structure of chitosan

殼聚糖含有3個反應性官能團，1個氨基和位于C6和C3位的2個羥基。氨基正電荷的存在使得殼聚糖成為自然界中唯一一種帶陽離子的天然多糖，—NH2的多寡同時也反映了殼聚糖的脫乙酰化程度。同時，氨基和羥基在經過酰化、羥基化、醚化、烷基化、酯化、接枝共聚、交聯、螯合等一系列化學修飾后[34]，形成的殼聚糖衍生物能進一步改善殼聚糖的溶解性和生物活性；這些官能團也為殼聚糖提供了加工成凝膠、涂層膜、包裝膜、納米纖維、支架、海綿狀物質、微粒和納米顆粒的條件，提高其生物抗氧化性、抗菌性和滲透性[35]。此外殼聚糖可直接進一步水解得到低聚殼聚糖，相對分子質量降至103左右[16]，同水解前相比，水解后的低分子質量殼聚糖的抑菌活性大大提高[3]。

2.3 殼聚糖的制備方法

2.3.1 化學法制備殼聚糖

化學法制備殼聚糖的常規做法是將甲殼素與40%～50%NaOH加熱混合，不同脫乙酰度的殼聚糖與反應溫度、時間和堿溶液濃度有關。堿處理后可將甲殼素中的N-乙酰基-D-氨基葡萄糖轉化為帶有游離—NH2基團的D-氨基葡萄糖單元[36]。但堿處理易造成環境污染，同時制得的殼聚糖易發生熱降解和分子鏈的過度水解，從而降低殼聚糖的品質。因而有學者提出采用資源化法從水產品中制備殼聚糖[1,16]，工藝步驟如圖4所示。這項技術的關鍵，一是將蝦、蟹殼中的有用成分都轉化為有用之物，二是在海邊的生產廠家可使用海水，減少淡水的消耗。化學法使殼聚糖的脫乙酰度快速增加，進而提高溶解度，但制得的殼聚糖易發生熱降解和分子鏈的過度水解，從而影響殼聚糖的品質。

圖4 資源化法制備殼聚糖Fig.4 Preparation of chitosan by resource method

2.3.2 生物法制備殼聚糖

生物酶法制備殼聚糖的原理是利用專一性酶對甲殼素進行脫乙酰基反應，可特異性、選擇性地切斷殼聚糖的 β-(1,4)糖苷鍵，降解過程和分子質量易于控制，條件溫和，對環境污染較少[2]。酶法制備殼聚糖是利用專一性酶對甲殼素進行脫乙酰基反應，該法的關鍵是獲得甲殼素脫乙酰酶(chitin deacetylase，CDA)。CDA酶解沒有標準的脫乙酰路徑，不同的CDA會在不同位置的N-乙酰基發生反應。溫度、pH值、金屬離子的作用對酶的活性具有很大影響。CDA存在于多種真菌及部分海洋細菌中，產CDA真菌分為(1)細胞質中存在CDA的Mucorrouxii和Absidiacoerulea；(2)胞外菌種培養中分泌CDA的Aspergillusnidulans及Colletotrichumlindemuthianum，海洋細菌CDA主要源于弧菌屬如Vibrioparahaemolyticus和Vibriocholerae[37]。目前CDA研究對象主要來源于廢棄的真菌，而細菌CDA的開發需要耗時耗力的菌種采集、初篩、復篩、鑒定和復雜的生物信息學表征，我國海洋資源豐富，細菌CDA的研究隨著宏基因組學和基因測序的發展具有更大的研究空間[38-39]。與化學法相比，生物法制備殼聚糖減少了環境污染，且具有較高的純度和品質，適用于食品工業。然而，由于產CDA菌株的來源少、產酶菌株活力不高、酶活較低等問題，該法仍停留在實驗室研究階段。

3 甲殼素/殼聚糖在食品工業的應用

甲殼素/殼聚糖成本低廉，并且對人體無毒無害，在食品工業中的應用尤其廣泛。國內外的各種機構都在積極研究這一物質的應用，日本開發的以甲殼素/殼聚糖為原材料的食品就達二十多種，對我國的食品工業有一定的啟示作用，近年來我國也在積極開展該產品在食品工業的應用研究。

3.1 功能性食品

甲殼素/殼聚糖作為一種天然高分子多糖，是一種優良的功能性食品和保健品，甚至被稱作是繼維他命丸、卵磷脂以及螺旋藻之后的第三代保健食品[40]。殼聚糖的陽性氨基基團能捕捉人體中帶負電的脂肪和Cl-，也能通過靜電作用結合膽汁酸，低分子質量殼聚糖甚至可滲透并修復胰島細胞，在降血脂、降血糖、降膽固醇、穩定血壓等方面發揮著巨大作用[41]。LüTJOHANN等[42]給116名肥胖患者服用殼聚糖后發現，患者血清中低密度脂蛋白和膽固醇含量顯著降低。PANITH等[43]發現殼聚糖可與膽固醇和膽汁酸有效結合，同時具有一定的脂肪結合能力并隨其分子質量的提高而顯著提高。

3.2 食品保鮮劑

殼聚糖具有成膜性和無毒性，將殼聚糖涂抹于果蔬表面可減少果蔬蒸騰作用，阻擋外界O2進入膜內，提高果蔬組織內CO2含量和減少乙烯逸出，達到果蔬保鮮的效果[44]。為了進一步提高殼聚糖膜的性能，常使用增塑劑和交聯劑，將殼聚糖與納米粒子、纖維和晶須等填料嵌入或與天然提取物和精油以及其他天然和合成聚合物混合，但該方法大多仍處于實驗室研究階段[45]。譚福能等[46]采用質量分數為1% 羧甲基殼聚糖、0.8%(質量分數)海藻酸鈉和納米二氧化硅為原料配制成復合保鮮液，對新鮮草莓進行涂膜處理后發現，復合保鮮液涂膜處理組的草莓保鮮效果最好，能有效阻止草莓水分的散失并抑制代謝，且隨著羧甲基殼聚糖取代度的增大，復合涂膜的保鮮效果有一定的提升。殼聚糖共混膜涂在水產品或肉制品表面，能與其中帶負電荷的脂質結合，減緩貯藏期間其脂質過氧化反應的發生，并抑制腐敗性細菌的繁殖[47]。ZHANG等[48]用殼聚糖-明膠基材包埋龍蒿精油裝載的納米膠囊復合膜涂于豬肉表面，提高豬肉的抗氧化、抗菌效果和感官品質。XIONG等[49]研制的葡萄籽提取物/nisin復合的殼聚糖-明膠可食膜體系，1%殼聚糖能有效地抑制豬肉氧化和微生物腐敗；1%殼聚糖與3%明膠和0.5%葡萄籽提取物加入后能進一步提高肉的抗氧化效果。

3.3 可食用包裝膜

殼聚糖的氨基基團可與微生物細胞膜表面的負電荷物質結合，也可以絡合微生物細胞中的金屬離子(通常作為酶的輔助因子)，制成薄膜后可對多種食物中有毒細菌和真菌表現出優異的抗菌活性，可以作為一種無毒、可食用、可降解的新型綠色包裝膜[34,50]。殼聚糖包裝膜的性能和其脫乙酰度、溶劑pH、溶劑類型、分子質量等因素有關，也通常與多糖、蛋白質、合成聚合物等共混提高膜的機械性能、O2和水蒸氣阻隔率[45]。MORADI等[51]以殼聚糖-低密度聚乙烯雙層膜為材料，采用低溫等離子體結合夏季香精油制膜對雞肉保鮮，結果表明等離子體處理可以改善薄膜的性能，夏香精油的殼聚糖/聚乙烯薄膜降低了水蒸氣和氧透過率，也提高了膜的拉伸強度和斷裂伸長率，從而提高雞肉的貨架期。

3.4 食品絮凝劑

殼聚糖分子上存在游離的帶正電氨基，能夠和酸及多酚類物質進行反應，并且它的長鏈線狀結構可在同一分子上吸附多微粒雜質并形成絮團，達到澄清液體食品的效果，不會影響食品的原有營養成分和風味，操作方便成本低[52-53]。ABDELMALEK等[54]使用殼聚糖作為澄清劑加入蘋果汁中，其透光率從原本的7.9%提高到91.1%。GASSARA等[55]研究了甲殼素和殼聚糖作為非均相絮凝劑在啤酒中的絮凝效果，通過比較啤酒的濁度、黏度、總固形物、總懸浮物、總多酚和zeta電位等指標，發現甲殼素和殼聚糖均能絮凝啤酒中的膠體顆粒，且優于傳統絮凝劑。

3.5 水處理吸附劑

殼聚糖分子結構中含有大量氨基N原子上的孤對電子，可進入到重金屬離子的空軌道中，通過配位鍵結合，形成很好的螯合物，能吸附如Pb(Ⅱ)，Cr(Ⅵ)，Cu(Ⅱ)重金屬離子，形成穩定的螯合物，使直鏈的殼聚糖形成交鏈的高聚物，凈化廢水[56 ]。但殼聚糖在酸性條件下有不穩定、易溶解等缺陷，限制了其廣泛應用。近年來，通過合成殼聚糖復合材料選擇性地去除食品廢水中的金屬離子[57]，也可通過對殼聚糖自身引入化學基團以提升其水溶性、電荷密度、相對分子質量及選擇性[58]。SONG等[59]制備了一種新型磁性硫/季銨化殼聚糖復合吸附劑，在中性條件下對所有被測金屬離子(As(Ⅴ)、As(Ⅲ)、Cu2+、Hg2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+)的去除率均較高，對Pb2+的吸附量高達235.63 mg/g，且具有良好的再生性能。

4 結論與展望

甲殼素/殼聚糖是一種新興的生物高分子材料，具有無毒性和較高的生物活性。甲殼素/殼聚糖來源范圍廣泛，工業上主要從廢棄的蝦蟹殼提取，提取方法主要可分為化學法和生物法。化學法作為現行的工業化提取工藝，雖然簡單高效，但是提取過程中使用的大量酸堿，容易造成環境污染和降低甲殼素/殼聚糖的品質，不符合綠色環保的循環經濟理念。生物法是節能、環境友好型的生產技術，可以生產優質的甲殼素和殼聚糖，但成本昂貴、產酸產酶速度慢、脫礦脫蛋白不充分、CDA 菌株活力不高等弊端，也成為了限制其工業化進程的關鍵問題。甲殼素/殼聚糖可應用在諸多領域，尤其是在食品工業中運用廣泛，可用作功能性食品、食品保鮮劑、可食用包裝膜、食品絮凝劑、水處理吸附劑等，但仍舊存在工業化程度低、產品性質不穩定、溶解性差的問題。鑒于以上諸多問題，可以從以下幾個方面進行改進：

在分離提取方面：(1)將化學/生物/物理法有機結合探索新的提取工藝，提高產品品質和資源利用率，擴大工業化規模；(2)通過誘變篩選優良高產菌種，優化發酵參數從而提高發酵效率，加強CDA源細菌的采集和基因庫的完善。另外，為了擴大甲殼素/殼聚糖成品在食品工業的應用范圍，可從以下方面入手：(1)對甲殼素/殼聚糖進行高品質的純化和深加工，探索控制產品分子質量、黏度和溶解性的方法。(2)進一步加大對甲殼素及殼聚糖衍生物的研發力度，提倡綠色環保的同時，進一步探索不同衍生物的生物活性，增加高附加值產品的產出，實現其更廣泛的應用。