板栗褐變控制方法研究現狀

郭玉曦，陳雪峰,2*，龔頻

1(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安，710021)2(陜西農產品加工技術研究院，陜西 西安，710021)

板栗屬于殼斗科，中國是最大的板栗生產國之一，板栗在我國的栽培歷史大約有兩千年之久[1]，根據世界糧農組織的統計，2018年我國板栗的種植面積有340 597公頃，板栗產量約為1 965 351 t，位居世界第一。板栗中含有豐富的蛋白質、淀粉、功能性多糖、粗纖維、氨基酸、礦物質等，同時還含有大量的天然多酚和類黃酮成分，這些活性成分具有很高的食用和藥用價值，對多種疾病預防起著重要作用，如預防心血管疾病、糖尿病[2]、抗腫瘤、改善免疫反應等[3]，同時板栗中異麥芽低聚糖常作為乳酸桿菌的有效促生長因子，對維持人體腸道的微生態平衡有重要的作用[4]。此外，板栗的外果皮中也含有很高的生物活性多糖、色素和酚類物質，具有預防炎癥，促進表皮傷口愈合的功能[5]，板栗外殼中的原花青素也可以誘導HepG2細胞自噬和凋亡[6]。

然而板栗在貯藏和加工過程中，很容易發生褐變、霉變[7-9]，此外，在低相對濕度和室溫下貯存時，由于快速失水，板栗很容易變干，發生鈣化[10]，導致風味降低、質量減輕，從而造成巨大的經濟損失。為此，國內外學者針對板栗貯藏和加工過程中的褐變問題采用了諸多食品保鮮技術并進行相關的研究。本文綜述了國內外近十年關于板栗褐變機理和控制褐變方法的相關研究，并提出相應的建議及展望，旨在為板栗的深入研究提供理論依據。

1 板栗褐變的發生機理

1.1 板栗的酶促褐變

板栗在貯藏和加工過程中果仁很容易發生酶促褐變[1,7-9,11-12]，相關酶-酚類物質的區域性分布遭到破壞，酚類物質立即被多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和過氧化物酶(peroxidase，POD)催化氧化為蒽酮化合物，在有氧條件下，醌類物質迅速聚合為深色物質，在這一過程中，酚類物質、酶和氧氣是發生酶促褐變的必要條件[9,13-14]。板栗酶促褐變對其營養，風味和色澤帶來不良影響，從而造成果農和相關企業的巨大損失。

1.1.1 酚類物質

板栗中酚類化合物的含量較高，在進行加工后，會發生明顯的褐變現象，但是目前國內外對于板栗酶促褐變底物的研究相對較少。陶月良等[11]對于板栗種子的酶促褐變底物進行了相關研究，認為單寧是板栗酶促褐變過程的底物，且板栗種子不同部位的單寧含量也存在顯著差異。但是國內外對于板栗完全成熟后的酶促褐變底物的相關研究很少，GONG等[12]對板栗中PPO和POD進行提取純化，并對2種酶進行完整的酶動力學的研究，分析其米氏常數(Km)和最大反應速度(Vmax)，研究表明板栗PPO的最適底物是鄰苯二酚(Km=92 mmol/L；Vmax=1.53 ΔOD/min)，其次是4-甲基鄰苯二酚和沒食子酸；板栗POD的最適底物是2-羥基苯酚(Km=9 mmol/L;Vmax=0.237 3 ΔOD/min)。

1.1.2 相關酶類

多酚氧化酶(PPO：EC 1.14.18.1)和過氧化物酶(POD：EC 1.11.1.7)在板栗中廣泛分布。多酚氧化酶是一種細胞內鄰二酚氧化酶，現有研究表明PPO活性的變化是引起板栗酶促褐變的主要原因。這種含銅的氧化還原酶催化多酚底物氧化成醌，然后通過非酶反應聚合成棕褐色物質，這一過程不僅造成顏色改變和抗氧化物質的降解，而且由于醌與其他化合物(如氨基酸、蛋白質、酚和糖類物質)的縮合而導致營養物質的損失[13-14]。

酪氨酸酶也是一種含銅的多酚氧化酶，是黑色素合成代謝中的限速酶，因此黑色素的含量的減少往往可以通過抑制酪氨酸酶的活性來實現[13]。TANG等[13]對板栗仁中多糖進行提取得到UEP-1，通過對酪氨酸酶抑制率及酶動力學測定，研究發現板栗多糖UEP-1是酪氨酸酶的一種競爭性抑制劑，可以推斷板栗在貯藏過程中本身就存在一定的褐變自衛作用。

POD作為另一種氧化還原酶，參與了植物的幾種代謝的過程，例如植物生長素的分解代謝、細胞壁的木質化、活性氧代謝[14-15]等，研究表明，在板栗貯藏和加工過程中POD催化板栗中的酚類物質發生褐變，之后經過脫水、聚合反應，最后形成黑褐色物質并在反應部位聚集發生板栗的褐變[12-14]。

1.2 板栗的非酶促褐變

1.2.1 Maillard反應

美拉德反應是一種典型的非酶促褐變反應，因食品的熱處理和貯存過程中結合帶有游離氨基和羰基的化合物而產生[16]。美拉德反應產生的各種反應產物可能會通過降低蛋白質的消化率，產生一些有害的化合物從而降低食品的營養價值。通常美拉德反應包括3個階段：早期、中期和最后階段，在美拉德反應的最后階段，還原酮、裂變產物和Strecker降解產物的醛醇縮醛和醛胺可縮合從而形成棕色的含氮聚合物，以及黑色物質高分子質量類黑精[17]。美拉德反應使食物具有獨特的香氣，風味和特殊的適口性[16]。LI等[18]研究了不同烹飪方法(煮、烤、炸)對板栗果仁中主要營養成分和揮發物含量的影響，結果表明新鮮栗子中的主要芳香成分是醛和酯，而由于美拉德反應以及糖、氨基酸和脂質的降解、在煮熟的栗子中形成了酮、糠醛和呋喃。

同時，由于板栗中含有較高的抗壞血酸含量，在板栗貯藏和加工過程中，抗壞血酸經過一系列的氧化、脫水、脫羧反應最終形成糖醛，作為美拉德反應的中間產物參與反應，從而加劇板栗褐變[19]。

1.2.2 酚類物質的非酶褐變

酚類物質的非酶褐變是指酚類物質的氧化及后續產生的氧化聚合反應。董翠[19]研究表明，在加熱、Fe3+存在的條件下，板栗中的酚類物質會發生自動氧化，從而使得板栗仁發生褐變。同時由于板栗(尤其是板栗澀皮)中含有較高的單寧物質(20.80 %)，而在板栗仁中很低，當板栗加熱糊化后，澀皮中部分可溶性單寧可能會滲入到板栗的果仁中，除此之外，當介質中有Fe3+的存在時，板栗中的單寧物質會氧化成深褐色，從而導致板栗褐變[19]。

2 板栗褐變的控制方法

2.1 物理方法

2.1.1 氣調處理

氣調保鮮是指在一定密閉的貯藏環境中，根據不同果蔬的貯藏特性，通過改變貯存環境中氣體組成的比例，為果蔬貯藏保鮮提供一個最佳的貯藏環境，從而抑制引起果蔬腐敗變質的生理生化代謝過程及腐敗微生物的生長繁殖，同時，氣調處理通過調節采后果蔬褐變相關酶(PPO、POD)及苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)的活性，并調控果蔬呼吸及相關代謝途徑中間產物及酶活性(丙酮酸脫氫酶、琥珀脫氫酶、細胞色素C氧化酶)、能量物質(NADH、NADPH、ATP、ADP、AMP)的含量，抑制果蔬的褐變，進而延長貨架期。目前國內外對于板栗氣調包裝的研究相對較少(表1)，CECCHINI等[20]采用15.20 kPa CO2+3.04 kPa O2對板栗進行氣調處理，發現可以保持板栗貯藏過程中較好的色澤品質，同時減少由于機械采摘產生的裂紋所引起的板栗腐爛。杜玉寬等[21]研究發現2%～5% O2+2%～4% CO2組合也可以維持板栗貯藏過程中的良好色澤，但對于板栗氣調處理過程中褐變相關酶的變化，以及調控果蔬呼吸及相關代謝途徑中間產物及酶活性、能量物質的含量沒有相關的研究報道，果蔬氣調保鮮技術目前在我國已經實現較為成熟的商業化、產業化應用，但是在板栗保鮮及褐變控制的應用卻很少，可能是由于板栗本身對于氣調氣體的敏感性較弱，同時板栗在貯藏過程中呼吸速率較慢，而氣調氣體及相關設備的使用成本較高，應用的性價比較低[33]。

表1 物理方法在板栗褐變控制中的應用Table 1 Application of physical methods in controlling the browning of chestnut kernel

臭氧(O3)是一種強氧化劑，具有GRAS(公認安全)狀態，目前在食品行業中主要作為消毒劑和抗菌劑而廣泛應用，食品貯藏過程中的蟲害及霉菌毒素也可以通過臭氧處理得到有效地消除，該處理的優點在于過量的臭氧會自動分解產生氧氣，而在食品中不會留下任何殘留[34]。李艷[22]研究發現，利用小于150 μg/L臭氧處理可顯著抑制板栗POD活性的降低，150 μg/L臭氧可以保持板栗良好的色澤品質。為了進一步研究抑制板栗的褐變，李艷[22]采用臭氧及減壓的聯合技術對板栗進行處理，結果表明先采用200 μg/L臭氧處理，去除臭氧后，抽真空至40.5 kPa可以保持板栗貯藏過程良好的色澤。除此之外李亞娜等[23]利用真空包裝+吸氧劑的組合處理，也可以保持板栗殼、仁的色澤，延緩褐變。

2.1.2 輻射處理

γ射線輻照處理目前已廣泛的應用于農產品的采后保鮮處理，γ射線輻照處理的目的主要是延遲果蔬的成熟、殺滅果蔬致病菌進而延長貨架期。國外關于伽馬射線輻照處理在板栗中的應用研究較為成熟，KWON等[25]研究表明，采用10 kGy/h γ射線輻射時板栗的色度指標(L*、a*、b*值)發生顯著的變化，保持良好的色澤品質，ANTONIO等[24]的研究也得出類似的結論，低劑量的γ射線輻照對貯藏期內板栗色澤的影響很小，但是高劑量的γ射線輻射對操作安全帶來更大的隱患，同時對輻射設備的要求及使用成本更高。ANTONIO等[35]系統地綜述了γ射線處理對板栗貯藏品質，生理特性，營養價值和抗氧化能力的影響，對比所有輻射劑量和儲存時間的研究報道，雖然低劑量的γ射線輻照處理對于板栗褐變的防止效果并不明顯，但是與未輻照的板栗相比，低劑量輻射處理可以保護板栗中生育酚和酚醛類抗氧化劑，并保持較高的抗氧化活性，顯著延長板栗的貯藏期。

此外，板栗的霉變和褐變常常是由于真菌感染造成的，尤其是青霉菌，而射頻(radio frequency，RF)處理作為一種高效、環保的物理加熱方法應用于農產品采后殺菌，HOU等[27]選用6 kW，27 MHz的自動化振蕩射頻系統與熱風加熱輔助的處理對板栗中的真菌進行熱滅活，結果表明，熱風加熱輔助處理能夠顯著抑制貯藏期內板栗青霉菌的生長，處理前后對板栗的質量不產生影響。但是由于自動化的射頻設備成本高昂，因此并不太適用于板栗產業化的應用。

微波技術已經在食品加工領域得到了廣泛的應用，例如干燥、加熱、烹飪工藝，巴氏殺菌以及食品保鮮技術[36]。微波通常是指電磁波，其頻率在300 MHz～300 GHz，通常微波頻率越低，穿透性越好，一般為了權衡使用的效率和成本，家用微波頻率通常為2.45 GHz，工業微波頻率通常為915 MHz[36]。微波技術在板栗保鮮上的應用研究也較多。張淑媛[28]運用低功率微波對板栗進行處理，研究結果表明195 W微波處理有效抑制和延緩板栗中VC的降解以及貯藏期間的呼吸作用，并有效減少板栗的腐爛。也有學者在板栗貯藏過程中采用分階段的方式進行低功率微波的二次處理，張淑媛[28]研究表明，在板栗貯藏第90天時，運用195 W的低功率微波進行二次處理可以有效降低板栗的呼吸作用，保持板栗良好色澤。同時，微波處理還會影響板栗多酚氧化酶和過氧化物酶的活性，何芮等[30]運用微波功率密度8 W/g處理板栗仁100 s，板栗仁的PPO、POD基本失活。此外，為了進一步抑制板栗的褐變，也有學者采用聯合技術而非單一的微波處理，張淑媛[28]運用不同功率的微波處理與不同濃度的1-MCP和ClO2進行正交試驗，結果表明，195 W低功率微波處理3 min+0.3 μg/L 1-MCP熏制+ 150 mg/L ClO2涂膜浸泡的組合處理貯藏效果最好，能夠保持板栗良好的色澤。

2.1.3 超高壓技術

高壓及超高壓加工是目前一種較為新穎的食品加工及貯藏技術，而熱處理目前正經歷工業發展的過渡時期，高壓及超高壓加工有可能逐漸替代熱加工處理[37]。在食品工業中，高壓處理通常是指在真空條件下對產品進行不連續地高壓處理，以避免處理后發生二次污染，因此對產品的包裝有很高的要求，需要能夠承受高達600 MPa及以上的壓力，通常將待處理的產品放入水平的圓柱形加壓釜中(目前商業化的設備可以容納50～525 L)，隨后，在容器中裝滿水，利用高壓泵進行加壓，在4～20 ℃保持壓力1～5 min[38]。國內外對板栗采取高壓/超高壓加工及貯藏技術的研究相對較少。郭豪寧等[31-32]研究超高壓對真空包裝峰甘板栗貨架期的影響，研究表明經過超高壓處理，峰甘板栗中酯類、醇類物質的種類及含量呈現下降趨勢，而酮、酸類物質含量有所增加，300 MPa處理5 min能夠有效地抑制峰甘板栗貯藏過程褐變的發生且能夠產生良好的風味物質，但目前還沒有關于超高壓/高壓處理對貯藏期板栗褐變相關酶的影響。

2.2 化學方法

基于化學的方法來控制采后果蔬的酶促褐變主要有2種不同的方式[39]：(1)作為還原劑，加入褐變抑制劑；(2)去皮后將果蔬浸泡在含有合成添加劑的涂膜液中。用作板栗PPO的抑制劑可根據其使用目的和作用機理分為以下四類[39]：(1)作為還原劑通過將鄰醌還原為無色的二元酚來間接抑制PPO的還原劑，例如含硫化合物和半胱氨酸[40]；(2)通過將pH降低至PPO的最適pH以下，從而作為非特異性酶滅活劑的酸化劑,如檸檬酸[41-42]，抗壞血酸[41-43]，水楊酸[44]，植酸[45]；(3)使用絡合劑，例如環糊精的疏水核心可以與包括酚類底物在內的多個分子形成復合物，從而防止其氧化為醌，從而防止形成棕褐色物質導致褐變；(4)使用螯合劑，通過將銅離子捕獲在酶的活性位點中而使PPO失活，如EDTA和草酸。這些合成添加劑可以混合在一起，或者與熱處理結合使用以達到協同抑制PPO活性的目的。

2.2.1 褐變抑制劑

國內外關于板栗褐變抑制劑的使用研究較多(表2)，因其成本相對較低，褐變抑制效果好，也是目前工業化使用的一種趨勢。一些酸類如植酸、檸檬酸、水楊酸等可以通過降低體系的pH及螯合Cu2+等抑制PPO活性，從而抑制板栗的褐變。LI等[45]研究表明植酸可顯著抑制板栗PPO和POD的活性，從而抑制板栗的褐變，同時，通過酶動力學的研究表明植酸是PPO和POD良好的競爭性抑制劑。ZHOU等[44]研究表明0.3 g/L水楊酸是PPO的競爭性抑制劑，顯著抑制板栗PPO的活性，從而抑制板栗的褐變。檸檬酸，抗壞血酸，L-半胱氨酸、EDTA-2Na，亞硫酸鈉等，這些常用的褐變抑制劑及其組合也廣泛的應用于板栗的護色[41-42]，除此之外，耿建暖等[46]利用蜂蜜(槐花蜜和葵花蜜)對板栗的褐變進行抑制，結果表明蜂蜜板栗PPO有一定的抑制作用，同時賦予板栗特有的蜂蜜香味，但當蜂蜜濃度大于2.0%則無明顯抑制效果。

表2 化學方法在板栗褐變控制中的應用Table 2 Application of chemical methods in controlling of chestnut kernel

2.2.2 可食用涂膜

食用涂膜通常是指利用可食用的涂膜包衣，通過浸涂或噴涂的方式涂在果蔬的表面，從而使得與外部環境之間形成的一種屏障，理想狀態下可食用涂層可以部分阻止水分的流動并改變果蔬內外的氣體交換，從而減少果蔬表面水分的流失，這不僅可以延緩果蔬的呼吸作用，同時抑制致病真菌的生長，從而延長貨架期。研究表明，可食用涂層的應用能夠顯著降低多酚氧化酶和過氧化物酶的活性，從而達到抑制果蔬褐變的目的，目前已廣泛應用于果蔬褐變的防治[50]。

國內外關于可食用涂膜在板栗褐變中的應用研究較多，目前最常用的板栗可食用涂膜是多糖類涂膜劑，如殼聚糖、殼聚糖與其他抑菌劑等的聯用。FERNANDES等[7]分別對比了海藻酸鹽溶液、殼聚糖溶液、乳清蛋白分離物混合液涂膜處理對板栗褐變的影響，結果表明所有處理的板栗其色度a*，b*值均呈現下降的趨勢，海藻酸鹽涂層處理的板栗的L*值呈現上升趨勢。王大紅等[47]采用0.2 g/kg納他霉素+0.5 g/kg山梨酸鉀+1%普魯蘭多糖的復合涂膜劑對豫羅紅板栗進行噴灑涂膜處理，研究結果表明納他霉素復合涂膜劑能夠抑制板栗PPO、POD、PAL的活性，減低霉變率，從而減少板栗的褐變。蘭霜等[48]利用殼聚糖復合涂膜組合對板栗進行涂膜保鮮處理，結果表明1.5%殼聚糖+2.0%茶多酚+0.2%海藻酸鈉的復合涂膜組合可以抑制板栗的褐變。此外也有學者使用納米涂膜液對板栗進行涂膜處理，初麗君[49]研究發現百里香酚殼聚糖納米級涂膜保鮮劑能夠保持板栗較好的組織狀態及栗殼色澤，但是對于貯藏期間褐變相關酶的變化并沒有報道。

3 展望

隨著近幾年對板栗褐變機理的進一步研究，如今對板栗酶促褐變過程中的褐變底物、相關酶活及非酶促褐變的機理已經有較為系統的理論解釋，但是對于板栗褐變相關酶動力學及褐變途徑的分子學研究還相對較少，板栗貯藏過程中褐變與呼吸、能量代謝的關系，板栗褐變相關酶調控基因的表達還沒有明確解釋，因此，深入研究板栗的褐變發生機理是有必要的。

目前，隨著科學技術的快速發展及對板栗褐變控制的深入研究，物理、化學處理能夠通過鈍化/消滅褐變相關酶，控制微生物生長繁殖等來抑制板栗的褐變。如今，可食用涂膜及褐變抑制劑已得到廣泛的應用，也將成為未來產業化的一種發展趨勢，但是人們越來越重視方便、快捷、健康的產品，對化學防褐變方法的安全性提出質疑。同時除了氣調、低溫、熱滅活等傳統物理法外，超高壓、電子束、熱頻、微波等新型設備的應用對儀器生產和操作成本的要求更高，這也對產業化提出了新的挑戰。因此，未來應加強以下研究以推進板栗褐變防治的產業化應用：(1)探索和開發天然提取物、蛋白類涂膜劑、納米涂膜液等更加安全的褐變抑制劑、可食用涂膜劑；(2)進一步研究可食用涂膜和褐變抑制劑等化學方法聯用時的作用機制及影響因素；(3)協同聯合使用物理、化學方法對板栗褐變進行控制，優化使用條件，研究其相互作用機制，實現物理化學方法優勢的協同互補；(4)嘗試用基因工程的方法對板栗的褐變進行生物學防治。