鄒燕羽,樊鳳嬌,方勇,李彭,黃沁沁,汪開拓
1(重慶三峽學院 生物與食品工程學院,重慶,404000)2(南京財經(jīng)大學 食品科學與工程學院,江蘇 南京,210023)
烷基間苯二酚(alkylresorciols,ARs)是WENKERT等首次在小麥、黑麥等谷物中發(fā)現(xiàn)的一類特殊的酚類類脂,具有兩親性[1-3]。ARs主要存在于高等植物中,如黑麥、小麥、大麥、銀杏和芒果中[4-5]。另外,也少量存在于苔蘚、藻類、真菌和細菌等低等植物以及真菌中[6-8]。ARs主要分布在谷物皮層,而不存在于精細制粉加工所得的谷類精制面粉或精制產(chǎn)品中,因此ARs可作為人體攝入小麥、黑麥等全谷物產(chǎn)品的生物標記物[9-10]。2015年,國家糧食和物資儲備局在糧食行業(yè)標準已將ARs選為評價全麥粉品質(zhì)的重要標準之一[11]。
ARs是1,3-二羥基-5-烷基苯衍生物的總稱,其苯環(huán)第5位上主要由奇數(shù)個碳烷基側(cè)鏈取代,從而形成了多種ARs同系物,如5-十七烷基間苯二酚(C17∶0)、5-十九烷基間苯二酚(C19∶0)、5-二十一烷基間苯二酚(C21∶0)、5-二十三烷基間苯二酚(C23∶0)和5-二十五烷基間苯二酚(C25∶0)等[12-14]。研究表明,谷物中的ARs同系物大多數(shù)是飽和的,不飽和的及含氧的同系物僅占0.5%~20%[15]。ARs的各個同系物的分子結(jié)構(gòu)不同,不同同系物之間僅相差若干個—CH2,因此化學性質(zhì)極為相似,同系物之間的極性相差較小。ARs特殊的兩親性有助于其發(fā)揮多種生理活性功能,如抗氧化、抗癌和抗腫瘤等,并對多種慢性疾病如肥胖、老年癡呆等具有一定改善作用[16-18]。ARs同系物的鏈長和結(jié)構(gòu)對其生理活性有重要影響。因此,ARs的分離純化及相應活性分析研究日益受到研究學者的關(guān)注與重視。
ARs作為全谷物產(chǎn)品中的生物標記物,在膳食營養(yǎng)領域具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑM瑫r,ARs是全谷物中的酚類物質(zhì),對人體內(nèi)抗氧化、代謝和腸道保健機制的發(fā)揮具有重要意義[19]。目前,國內(nèi)外學者們已對ARs開展了大量的研究,包括提取、分離、純化以及生理活性等方面。本文主要綜述ARs的分析技術(shù)及其生理活性研究,探究各個分析方法的優(yōu)缺點和未來的發(fā)展方向,旨在為快速、準確地分析不同基質(zhì)中的ARs提供方法參考。同時,經(jīng)過系統(tǒng)地梳理其生理活性,本文將為ARs在慢性疾病預防方面提供方向指導,并期望進一步引起人們對全谷物食品的關(guān)注。
有機溶劑提取法是根據(jù)不同物質(zhì)組分在有機溶劑中溶解度的差異,將生理活性物質(zhì)從原料中提取出來的方法。依據(jù)相似相溶原理,ARs能夠迅速溶于有機溶劑中,有機溶劑提取法是ARs的常規(guī)提取方法。該方法操作簡單,常作為首要步驟并與其他提取方法如超聲索氏提取、超聲或超臨界萃取相結(jié)合。ARs的常用提取溶劑主要有乙酸乙酯、丙酮、正丁醇和二氯甲烷等,目前使用最多的是乙酸乙酯[20-21]。有機溶劑提取技術(shù)原理簡單,對設備的要求較低,成本低廉。但是大多數(shù)的有機溶劑都具有低毒性,且易造成環(huán)境污染。因此,開發(fā)高效、低毒環(huán)保的提取ARs的方法,成為了研究熱點。
超聲輔助萃取法的工作原理主要是利用超聲波的空化作用,使樣品物料的細胞膜和細胞壁在提取過程中充分破碎,從而加快目標物質(zhì)的釋放與提取。同時,超聲波不會對提取物的結(jié)構(gòu)和活性造成影響,且對提取物中熱穩(wěn)定性差的活性組分的破壞性低[22]。超聲波輔助提取具有速度快、得率高、溫度低和能耗低等優(yōu)點,在ARs的提取方面具有較強的適用性。彭田園等[17]采用超聲波輔助提取手段,研究了超聲功率、提取時間及料液比3個因素對ARs 提取量的影響。研究表明,該方法可大大提高提取效率,且樣品用量少、重復性好,適用于全麥粉中ARs的快速提取。因此,采用有機溶劑輔助超聲波萃取有助于ARs提取效率的提高。
超臨界流體萃取法是新興的分離提取新技術(shù),被廣泛應用于食品、醫(yī)藥和石油化工工業(yè)等方面[23-24]。其萃取原理是在較低溫度下,通過增加設備中壓力,使萃取氣體轉(zhuǎn)化為液體,對處于臨界狀態(tài)的物質(zhì)進行萃取、分離和純化,具有效率高、無殘留和對目標成分損壞小等優(yōu)點。超臨界流體萃取法比傳統(tǒng)萃取提取技術(shù)更具優(yōu)勢。超臨界流體萃取法一般不選用有機溶劑,因此無有機溶劑殘留和污染。提取過程溫度低,能最大限度地保留活性物質(zhì)的生理活性和天然風味等。同時,超臨界流體萃取中的萃取流體CO2價格便宜并可循環(huán)使用。GUNENC等[25]利用極性助溶劑(10%乙醇)與非極性流體(CO2)相結(jié)合的方法提高了ARs的萃取率。雖然超臨界流體萃取技術(shù)具有諸多優(yōu)點,但是由于設備操作成本高,CO2需求量大,僅適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
固相萃取法(solid phase extraction, SPE)通過選擇性吸附與洗脫對樣品進行富集、分離凈化,是在液固萃取和液相色譜柱技術(shù)基礎上產(chǎn)生的一項前處理方法。與傳統(tǒng)的液液萃取相比,固相萃取具有簡便、高效、低能耗等特點,在樣品前處理中發(fā)揮著重要作用[26]。固相萃取小柱是利用固相萃取的原理衍生出來的商業(yè)產(chǎn)品,已被廣泛運用到實驗室的研究工作中。根據(jù)待分析樣品性質(zhì),選擇不同介質(zhì)的SPE小柱。常用的SPE小柱有硅膠柱、C18柱、HLB柱、陰離子交換柱和硅藻土柱等[27]。MARKLUND等利用SPE小柱對尿液進行前處理,再經(jīng)過高效液相色譜-庫侖電極陣列檢測器和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用對ARs代謝物3,5-二羥基苯甲酸和3-(3,5-二羥基苯基)-1-丙酸進行定量,結(jié)果表明SPE小柱對待測樣品具有良好的凈化效果,可用于樣品分析的前處理[28]。然而,選用SPE進行前處理也存在一定局限性,這可能是由于ARs是酚類油脂,在進行分析測定時,極易殘留在SPE小柱上,使分析結(jié)果重現(xiàn)性降低,且容易引入雜質(zhì)干擾后續(xù)分析結(jié)果。另外,SPE小柱容量小、價格昂貴,僅適用于ARs的分析檢測而不能進行大量制備。
薄層色譜,又稱薄層層析(thin layer chromatography, TLC),能夠?qū)崿F(xiàn)微量物質(zhì)的快速分離和定性分析。TLC法的原理與柱層析相同,TLC是以玻璃板上涂布的吸附劑作為固定相,再選擇適合極性的溶劑作為流動相,實現(xiàn)對混合樣品分離、鑒定和定量的目的。TLC能夠快速有效地分離脂肪酸、氨基酸和生物堿等物質(zhì),從50年代發(fā)展起來至今仍被廣泛采用。ARs是特殊的酚類脂質(zhì),粗提物中由多種ARs同系物組成,可以采用TLC法對其初步分離后進行定量和定性。郭亞洲采用TLC法,選用石油醚-乙酸乙酯混合溶液作為展開劑進行薄層色譜分離,根據(jù)ARs標品對應的Rf值確定麥麩中ARs的位置,成功實現(xiàn)粗提物的初次分離純化[29]。PATZKE等認為ARs提取物中同時存在飽和與不飽和同系物,通過半制備液相色譜對各個ARs同系物進行單體制備難度較大,應當使用TLC法進行初分離[30]。然而,TLC法比較耗時,成本較高,且存在目標物不可逆吸附現(xiàn)象[31]。
硅膠柱層析根據(jù)待分離物與硅膠吸附力的強弱實現(xiàn)不同極性物質(zhì)的分離。一般情況下,極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附,極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附。根據(jù)待分離物極性的差異,選擇不同極性的洗脫劑。待分離物極性小用乙酸乙酯和石油醚洗脫,待分離物極性較大則用甲醇和氯仿洗脫。經(jīng)過吸附、解吸、再吸附、再解吸的層析過程,即可實現(xiàn)樣品的分離。LIU等利用硅膠柱層析,選用氯仿-乙醚混合溶液為洗脫液分離純化得到ARs同系物[32]。WANG等以相同的方法,將硅膠柱層析分離純化得到的小麥ARs運用到氧化損傷的人視網(wǎng)膜細胞保護作用的研究中[33]。
經(jīng)比較3種純化方法的優(yōu)缺點后,在我們之前的實驗中,采用硅膠柱層析對ARs乙酸乙酯粗提物進行純化,成功獲得ARs純化物。經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定,可知ARs純化物中僅含7種同系物,且純度和分離度較高。實驗表明,硅膠柱層析能夠有效地除去ARs粗提物中的其他活性成分,可以實現(xiàn)ARs同系物的純化和富集。雖然使用硅膠柱層析進行樣品純化耗時較長,但其具有操作簡單、適用性強、成本低廉等優(yōu)點,適用于實驗室大量分離純化ARs。
基于ARs與Fast Blue B鹽在酸性甲醇中形成有色衍生物,可以通過分光光度法測定ARs的含量[34]。該方法簡單、快速和足夠靈敏,可用于ARs的分析研究。在色譜法發(fā)展之前,分光光度法已被廣泛應用于ARs的定量研究中。SAMPIETRO等對傳統(tǒng)的分光光度法進行改良,提出使用Fast Blue RR重氮鹽取代Fast Blue BB鹽,開發(fā)了一種新的、可量化小麥和黑麥谷物及其麩皮或全谷物產(chǎn)品中ARs的微量比色法[35]。該方法顯色反應的靈敏度和穩(wěn)定性均得到顯著提高,可被運用到ARs的定量研究中。2015年,國家糧食行業(yè)LST 3244—2015中制定了有關(guān)全麥粉中ARs的測定方法。該行業(yè)標準利用顯色反應的原理,選用Fast Blue B鹽,采用分光光度法測定谷物中ARs的含量[9]。雖然此方法對微量的間苯二酚具有較高靈敏度,但也存在一些不足之處。LANDBERG等在比較氣相色譜法和比色法測定谷物及其制品中的ARs時發(fā)現(xiàn),分光光度法測定的ARs含量高于氣相色譜法,這可能是由于Fast Blue鹽會與其他酚類化合物發(fā)生反應[36]。同時,分光光度法只能實現(xiàn)ARs的定量,無法區(qū)分樣品中ARs的同系物組成,因而該方法在ARs同系物的研究中存在一定局限性。
氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography - mass spectrometry, GC-MS)是在將氣相色譜和質(zhì)譜檢測結(jié)合起來的綜合性分析技術(shù),既具有氣相色譜分離效率高、分析簡便等特點,又具有質(zhì)譜技術(shù)的高鑒定判別能力,因此,該方法被廣泛應用于復雜組分的分離與鑒定,可適用于多組分和未知組分的定性定量分析,是生物樣品中藥物與代謝物定量、定性分析的有效工具。2001年,ROSS等選用脂肪酸甲酯作為內(nèi)標,通過氣相色譜分析黑麥籽粒ARs提取物,建立了一種快速簡便分析黑麥籽粒中ARs的方法。通過氣相色譜/質(zhì)譜法鑒定ARs,發(fā)現(xiàn)主要同系物含有C17∶0,C19∶0,C21∶0,C23∶0和C25∶0[37]。在此研究基礎上,ROSS等對烘焙后的谷物產(chǎn)品中ARs進行測定,研究發(fā)現(xiàn)高溫烘焙后,ARs未被破壞,證明ARs可耐高溫具有穩(wěn)定性[38]。另一方面,MARKLUND等發(fā)現(xiàn)該方法適用于血液和尿液中ARs的分析測定[39-40]。ROSS等采用GC-MS對食用藜麥受試者血漿進行檢測,發(fā)現(xiàn)ARs可作為人體攝入藜麥的生物標記物[41]。
高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(high performance liquid chromatography - mass spectrometry, HPLC-MS)是將高效液相色譜和質(zhì)譜檢測結(jié)合起來進行分析和鑒定的技術(shù)。該方法高效快速、靈敏度高,樣品預處理簡單,適用于含量低、不易分離樣品的檢測分析,已被廣泛應用于天然產(chǎn)物的定量和定性分析的研究中[42-43]。MULLIN等對比了熒光測定法、氣相色譜分析和HPLC法這3種測定方法,研究結(jié)果表明,在定量方面HPLC法是最準確的分析方法[44]。在此基礎上,前人將其與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合起來,運用于ARs的定量和定性分析中。由于ARs在280 nm處具有明顯的吸收峰,結(jié)構(gòu)中含有的不同類型基團,當處在電噴霧和大氣壓化學源等離子源作用條件下,會發(fā)生離子化裂解而形成不同分子質(zhì)量的特征碎片。通過對質(zhì)譜多級碎片的特征結(jié)構(gòu)分析,能迅速對ARs進行結(jié)構(gòu)鑒定。KNODLER等采用HPLC-MS技術(shù)并結(jié)合固相萃取的樣品前處理技術(shù)測定表征了芒果皮中ARs,并且該方法被用于不同基質(zhì)中ARs的測定和結(jié)構(gòu)表征[45]。ROSS等利用HPLC-MS技術(shù)檢測人體血漿中的ARs。采用該方法,無需對樣品進行固相萃取或化學衍生,可大大提高實驗室檢測分析的效率,并降低了實驗室消耗成本[46]。
綜合分析比較3種檢測方法后,在我們課題組的研究中(未發(fā)表),采用HPLC-MS技術(shù)對硅膠柱層析所得的ARs純化物進行結(jié)構(gòu)鑒定,實驗表明ARs純化物中含的7種同系物,分別為C17∶0、C19∶1、C19∶0、C21∶1、C21∶0、C23∶0和C25∶0。
ARs的分子結(jié)構(gòu)與生育酚的分子結(jié)構(gòu)相似,其間位含有2個羥基,可以給出質(zhì)子清除氧化自由基,具有抗氧化活性[47]。與生育酚相比,ARs的抗氧化活性較弱,在相同濃度下,生育酚的抗氧化活性CARs同系物C15∶0高大約10倍。然而,在生物膜的氧化性研究中,ARs展現(xiàn)出了很強的抗氧化特性[48]。ARs長鏈能夠插入細胞膜中,通過氫鍵相互作用與磷脂結(jié)合形成低聚物和聚合物復合物,從而引起雙層結(jié)構(gòu)和性能的改變,發(fā)揮生物膜的保護作用[49]。同時,ARs可以抑制脂質(zhì)的過氧化,進而調(diào)節(jié)生物膜中油脂的氧化反應,維持膜屏障功能穩(wěn)定達到抗氧化目的[50]。ZUBIK等研究發(fā)現(xiàn)長鏈ARs同系物可以有效抑制Fe2+誘導的脂質(zhì)體膜中脂肪酸和磷脂的過氧化,以及甘油三酯和脂肪酸的自氧化[51]。KOZUBEK等研究發(fā)現(xiàn)黑麥ARs對H2O2誘導的紅細胞膜脂質(zhì)氧化具有保護作用[52]。WANG等研究了小麥ARs對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞氧化應激的保護作用及其可能機制,實驗結(jié)果表明ARs能夠顯著降低過氧化氫誘導的活性氧水平,增加抗氧化反應基因GCLM、GCLC、NQO1和HO-1的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達,通過Nrf2/HO-1信號通路保護ARPE-19細胞免受氧化應激誘導的細胞損傷[33]。另外,谷物ARs的抗氧化特性可以保護食品在加工和貯藏過程中的品質(zhì)安全。由于ARs幾乎不存在于精細面粉或精加工谷物產(chǎn)品中,因此全麥面包的貨架期會比精細小麥粉制作的面包具有更長的貨架期[53]。因此,作為一種天然抗氧化劑,ARs在食品工業(yè)和生理活性研究方面具有潛在的重要性。
隨著人們生活方式的改變,糖尿病的發(fā)病率日益攀升,且呈現(xiàn)年輕化的趨勢[54]。流行病學研究表明,攝入全谷物產(chǎn)品可以提高人體對胰島素的敏感性,并可在一定程度上控制體重并降低患糖尿病的風險[55-56]。脂代謝異常會使血漿中游離脂肪酸水平升高和脂肪沉積,導致糖尿病的發(fā)病率上升。長期攝入高含量的ARs能夠有效抑制激素敏感脂肪酶與其他脂肪酶的活性,能夠減少體內(nèi)脂肪的分解和降低血漿中游離脂肪酸的水平,進而降低患糖尿病的風險[57]。同時,ARs的攝入量與患糖尿病風險之間具有相關(guān)性。BISKUP等研究發(fā)現(xiàn)人體攝入全谷物食品后,血漿中ARs的濃度水平會升高,血漿中ARs同系物C17∶0/C21∶0的大小與患糖尿病的機率呈反比[58]。
當今社會,肥胖問題已經(jīng)成為人們?nèi)找骊P(guān)注和討論的話題。我國的肥胖問題已初見端倪,肥胖給人們帶來的健康問題,已經(jīng)上升到社會和經(jīng)濟層面[59]。預防超重和肥胖現(xiàn)象已成為關(guān)乎所有國民身體素質(zhì)的重大公共衛(wèi)生問題[60]。流行病學研究表明,全谷物的攝入可以降低肥胖的風險。OISHI等研究麥麩ARs對飲食誘導的肥胖小鼠代謝紊亂的影響發(fā)現(xiàn),ARs可有效抑制腸道對膽固醇的吸收,使得血液中膽固醇的濃度降低[61]。ARs可以通過上調(diào)肝臟膽固醇合成基因的表達,提高糞便中膽固醇的排泄率從而抑制肝臟脂質(zhì)在體內(nèi)的積累。同時,ARs可有效提高小鼠日內(nèi)的葡萄糖耐受性和對胰島素的敏感性,從而降低由飲食引起的肥胖率。另外,在體外活性實驗中發(fā)現(xiàn),ARs對脂代謝的影響主要是通過抑制脂質(zhì)代謝酶的活性來實現(xiàn)的,如甘油-3-磷酸脫氫酶[62],生育酚-ω-羥化酶[63]和α-葡糖苷酶[64]等。當體內(nèi)的脂質(zhì)代謝酶被抑制后,機體的新陳代謝速度加快,脂肪積累量減少。同時,身體對食物中碳水化合物消化率降低,防止由于碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪而引起的肥胖。
ARs是麥麩中預防結(jié)腸癌的主要生理活性成分,可以通過抑制細胞凋亡來抑制癌細胞的生長。楊春等研究發(fā)現(xiàn)ARs可通過增強Bax、PARP1和Caspase3表達,抑制BCL2表達和促進Bax/BCL2的表達,從而誘導人結(jié)直腸細胞HT29及HCT116的凋亡,對人結(jié)腸癌的防治具有重要意義[65]。FU等進一步研究ARs的抗結(jié)腸癌作用機制,研究發(fā)現(xiàn)ARs可激活人體抑癌基因p53的表達和降低癌基因Mdm2的表達水平,激活癌癥細胞死亡中涉及的多種細胞效應,如抑制蛋白酶體和線粒體凋亡通路以及調(diào)節(jié)細胞周期,從而發(fā)揮抗腫瘤作用[66]。另外,研究表明,ARs可以降低結(jié)腸癌細胞排泄物的毒性作用,從細胞代謝環(huán)境的角度降低結(jié)腸癌細胞的增殖率。同時,ARs能夠加速細胞代謝過程中產(chǎn)生的具有遺傳毒性細胞的凋亡,從而抑制癌細胞的增殖[67]。
神經(jīng)退行性疾病是全世界老年人死亡的主要慢性疾病之一。神經(jīng)退行性疾病是腦部神經(jīng)元變性或死亡導致的慢性進行性中樞神經(jīng)疾病,包括阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病等[68]。神經(jīng)退行性疾病的主要臨床表現(xiàn)為認知功能障礙、運動功能障礙和和免疫炎癥等[69]。大量研究結(jié)果表明,氧化應激通常伴隨著大量活性氧的產(chǎn)生,是神經(jīng)退行性疾病的主要發(fā)病原因。而大腦自身抗氧化能力較弱,生理活動活躍需要大量氧供給,使大腦比其他器官更易受到氧化應激的影響[70]。前人研究發(fā)現(xiàn),天然產(chǎn)物可以作為靶點藥物調(diào)節(jié)酶和受體的活性,從而預防退行性神經(jīng)疾病[71]。然而,國內(nèi)外關(guān)于ARs在神經(jīng)保護作用方面的研究較少。ARs是一種兩親性酚脂物質(zhì),具有良好的膜滲透能力,能夠進入神經(jīng)元細胞,到達目標靶點清除自由基發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本課題組前期(未發(fā)表)研究采用H2O2誘導的HT22細胞構(gòu)建神經(jīng)元氧化損傷模型,結(jié)果表明ARs可以降低乳酸脫氫酶泄露率、膜脂質(zhì)過氧化物含量、活性氧和細胞凋亡率,提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性,并通過Nrf2-ARE信號通路降低氧化應激對HT22細胞的氧化損傷。因此,我們可以推斷ARs可作為神經(jīng)保護劑。在今后的研究中,仍需要進一步深入研究ARs對氧化應激導致的神經(jīng)退行性疾病的保護機制。
ARs是人體攝入全谷物產(chǎn)品的生物標記物,也是一種很好的天然功能食品添加物,在評價全谷物產(chǎn)品質(zhì)量以及營養(yǎng)功效方面具有重要作用。然而,目前國內(nèi)對ARs的研究還處于起始階段,主要表現(xiàn)在幾個方面:(1)ARs的提取方法大多還采用有機溶劑法,尚缺乏綠色、高效的提取技術(shù);(2)ARs的研究主要集中在谷物產(chǎn)品中定量和定性研究中,對其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征尚不清楚;(3)ARs的生理活性研究多局限于體外模型,體內(nèi)活性的研究較少,且暫未研究各同系物與其活性之間可能存在的關(guān)系;(4)ARs未能應用到食品工業(yè)上,導致大量麥麩未能得到合理的利用,從而造成自然資源的浪費。在今后的研究中,應當重視開發(fā)快速、高效的ARs檢測方法,尤其是對ARs各同系物單體制備技術(shù)的研究,進而有助于深入探究其結(jié)構(gòu)和功能特性之間的關(guān)系。同時,擴大其在食品工業(yè)上的應用范圍,提高谷物副產(chǎn)物的利用度和經(jīng)濟效益。此外,ARs生理活性方面的研究,應擴大篩選范圍,確定幾種典型的生理活性作用。再進一步深入到ARs的體內(nèi)活性研究上,探究ARs在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化關(guān)系和作用機理,以期發(fā)掘其在膳食營養(yǎng)和疾病預防方面的重要作用。