不同酵母菌發酵對生姜梨酒品質的影響

曾智娟，鄧杰,2，任志強,2，張蘭蘭，車路萍，衛春會,2*，黎仲冰

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644000) 2(釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644000) 3(中國人民解放軍原濟南軍區新技術農副業生產基地，山東 鄒城，273517)

梨營養豐富，口味極佳[1]，近年來，梨產量不斷增大，據中國農產品年鑒顯示，2017年梨產量達 1 641萬t，位居全國水果產量第三，全世界梨產量第一。但梨果面臨保鮮時間短、運輸困難、深加工途徑少等問題，希望通過加工梨成酒的方式增加其深加工途徑，減緩梨果滯銷現狀，對國家扶貧攻堅政策給予支持。

生姜梨酒是以梨、生姜為原料經破碎、榨汁等處理后按照一定配比混合發酵的新型果酒[2]。其汲取梨中豐富的維生素和氨基酸等營養物質，又汲取生姜中的姜油酮和辛辣成分，既融合了梨生津、清熱、潤燥的功效，又融合了生姜驅寒、和胃、祛風的功效，具有增強人體內分泌、提高免疫功能、抗氧化等作用。生姜梨酒發酵過程中產生的香氣成分、酒精度、有機酸等決定著果酒風味及口感。關于梨酒的研究，目前主要集中在梨品種對比[3]，發酵工藝的優化[4-5]、酵母種類的篩選[6-7]、梨酒香氣成分[8-9]等方面研究，但由于大多發酵采用葡萄酒酵母釀造，缺乏專用梨酒釀酒酵母，這制約了高品質生姜梨酒生產。

本研究利用由實驗室篩選的5種不同酵母菌種及產香酵母和產酒精酵母的復配來發酵生姜梨酒，研究酵母菌種對生姜梨酒品質的影響，通過測定其酒精度、糖度、酸度等理化指標，感官評定、對其香味成分的分析，最終選出適合生姜梨酒發酵的最優酵母及組合，以期釀造出高品質的生姜梨酒，為其發酵加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪花梨、生姜、白砂糖、土豆，市售；Yeast-W2、Yeast-全興5#、Yeast-NJSYS-70、異常畢赤酵母(Pichiaanomala)，釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室提供；安琪果酒酵母，湖北安琪果酒酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設備

MJ-25BM05C榨汁機，廣東美的精品電器有限公司；WYT-ⅡA手持式糖量計折射儀、7890A-5975B氣相色譜質譜聯用儀，美國Agilent公司；HT300A固相微萃取儀，意大利HTA公司；XMT-100C恒溫培養箱，重慶市永生實驗儀器廠；Bioflo310型發酵罐，美國NBS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 生姜梨酒生產工藝流程

1.3.2 操作要點

選取雪梨去皮破碎成汁后，加入0.1%的抗壞血酸、0.2%的檸檬酸進行護色處理，加入新鮮老姜片，生姜梨汁質量比1∶30[10]，加90 mg/L偏重亞硫酸鉀進行SO2處理，調整糖度到21%，8%的接種量，28 ℃恒溫靜置培養，發酵時間為8 d，測定酒精度、還原糖、總酯等指標，并進行感官品評評定和GC-MS檢測。

1.3.3 試驗方法設計

單一酵母發酵實驗設計：將Yeast-W2(編號為A)、Yeast-全興5#(編號為B)、Yeast-NJSYS-70(編號為C)、Pichia anomala(編號為D)、安琪果酒酵母(編號為E)以9%的接種量分別接入發酵液中，待發酵結束后進行感官評定、理化指標測定和風味物質分析。

復合酵母發酵試驗設計：以產酒精酵母(B、E)和產香酵母(A、C、D)兩兩組合進行混菌發酵生產生姜梨酒，以所得梨酒的理化指標和感官評價綜合分值作為依據，確定最佳發酵酵母組合。

1.3.4 測定方法

理化指標檢測：酒精度、還原糖、總酸參照《葡萄酒、果酒通用分析方法》(GB/T 15038—2006)執行；酒精度以酒精計法測定；總酸以酸堿滴定法測定，以蘋果酸計(g/L)；還原糖以直接滴定法測定，以葡萄糖計(g/L)；總酯參照《白酒分析方法》 GBT 10345—2007，以酸堿中和法測定。

感官指標品評：選取10位具有品酒經驗的師生，參照GB/T—15038《葡萄酒、果酒通用分析方法》，從外觀、香氣、口感等方面評價酒樣。具體評定標準見表1，最終結果制成感官雷達圖。

1.3.5 生姜梨酒風味物質氣相色譜-質譜 (GC-MS)檢測方法

氣相色譜條件：毛細管色譜柱為DB-WAX，規格為60 mm×250 μm×0.25 μm；不分流進樣，進樣口溫度為230 ℃；升溫程序：40 ℃保持1 min，然后5 ℃/min升溫到180℃，保持1 min，再8 ℃/min升溫到230 ℃，保持7 min；載氣：99.999% He，流速為1 mL/min。質譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，質量掃描范圍20～500 u，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，接口溫度230 ℃，溶劑延遲3 min[11]。

定性分析：根據總離子流圖檢測出揮發性組分的質譜圖，通過與標準譜庫(NIST05a.L)對比鑒定，匹配度大于75%的予以確認。數據處理：通過GC-MS分析檢測得出生姜梨酒風味物質的總離子流圖，采用數據分析軟件進行譜庫檢索及相關文獻分析，對相應的風味物質成分進行鑒定。

1.4 數據處理

本試驗利用 Microsoft Office Excel 2010 軟件進行數據的基本處理，用 IBM SPSS Statistics 21.0 分析軟件進行方差分析，用 LSD法對數據進行差異性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同酵母發酵對生姜梨酒理化指標的影響

2.1.1 不同酵母發酵對生姜梨酒酒精度的影響

比較5株單一酵母及其兩兩復配后發酵的梨酒酒精度，結果如圖1所示。

5株單一酵母復配酒精度范圍為7.15%～12.42%vol，其中B和C復配發酵酒精度為7.15%vol，明顯低于B、C單菌發酵的酒度(P<0.05)。原因可能是2個酵母生長發酵過程中相互制約，影響彼此酵母生長及后期轉化酒精速率。相同糖度情況下，酒精轉化率越高，則此酵母的產酒能力越強[12]。由圖1可知，B、B與D、E與D或C復配發酵不存在顯著性差異(P>0.05)，產酒能力最佳，達12.42%vol，高于其他幾個組合。其中E與D復合發酵與其單菌發酵存在顯著性差異(P<0.05)，說明E與D復配在產酒精方面為相互促進作用。

2.1.2 不同酵母發酵對生姜梨酒還原糖的影響

比較5株單一酵母及其兩兩復配后發酵的梨酒的還原糖含量，結果如圖2所示。

5株單一酵母還原糖質量濃度范圍為0.58～14.98 g/L，發酵基本完成。復配后范圍為1～59.4 g/L，其中A和B復合發酵還原糖為48.0 g/L，B和C復合發酵還原糖為59.4 g/L，與其他酒樣存在差異性顯著(P<0.05),發酵不完全，原因可能是：在相同的發酵時間條件下，A和B、B和C酵母在共發酵過程中為生長競爭性抑制，可能存在B代謝物質影響另一酵母對糖的轉化能力，降低糖的利用率，發酵速率較慢。遂在相同發酵時間內，此2種梨酒還未完成發酵，發酵力低于其他酵母。而D、E及D與E復配的還原糖很低，側面反映相同時間內其酒精轉換能力較好。

2.1.3 不同酵母發酵對生姜梨酒總酸的影響

比較5株單一酵母及其復配后發酵的梨酒的總酸含量，結果見圖3所示。果酒中適當的酸含量有利于賦予果酒適口性，改善酒體顏色，抑制雜菌，增加酒體穩定性[13]。總酸較低，則酒體柔和、圓潤；若總酸量過高，則酒體粗糙、瘦弱。此外，總酸也能影響果酒的顏色和穩定性。由圖3可知，5株單一酵母及復配果酒酸度范圍為2.370～3.446 g/L。其中E無論是單一發酵還是與C復配，酒樣酸度均最高，達到3.446 g/L左右(P>0.05)。結合品酒員對生姜梨酒的嘗評結果，D與E的總酸為3.240 g/L為最適酸度，增加酒的爽口性、協調性。本結果與田學梅[10]梨酒的最適酸度4.00 g/L有差異，原因可能是梨酒的糖酸比不同影響了酸的適口性，相同酸度情況下，糖度越低，對酸度的敏感性越強。

2.1.4 不同酵母發酵對生姜梨酒總酯的影響

比較5株單一酵母及其復配后發酵的梨酒的總酯含量，結果見圖4所示。

酯類是果酒香氣物質的組成成分，其中酵母菌在發酵和陳釀過程中賦予果酒濃郁的酒香，是影響果酒香氣特征最關鍵因素之一[14]。可以通過測定總酯大概判斷酒類風味的豐富程度[15-16]。由圖4可知，除了E+A組合以外，其他5種復合酵母組合總酯含量有顯著性差異(P<0.05)，但相較于單菌發酵，總酯含量均有所提高，酵母復配利于增加果酒風味的豐富性。

2.2 不同酵母發酵對生姜梨酒感官品質的影響

理化分析結果僅視為果酒的感官質量提供參考，果酒實際評價應針對視覺、嗅覺、味覺方面的刺激所形成的總體印象而判斷。不同酵母發酵對生姜梨酒品質的影響的感官雷達圖見圖5所示。綜合圖5中的外觀、香氣和口感3個指標得出：單一酵母中，綜合感官評價得分最高的是E發酵的生姜梨酒，為84分，其風味口感最佳，果香、酒香突出，有淡淡的生姜清香，酒體豐滿，口感醇厚；其次是D為82分，果香、酒香、姜香突出，酸甜適中；B與C酒樣的感官評分相差不大，其中A的得分最低，酒體比較單薄。復配酵母中，E+D酒樣得分最高為88分，其酒體澄清，色澤淺黃有光澤，口感醇厚，酸甜適中，具有濃郁的梨果香和淡淡的生姜香，典型性比較明確。其品評結果與理化指標測定中體現的菌株的發酵力、降糖能力、總酸最適含量結果基本一致。因此，綜合理化分析和感官評價發現安琪果酒酵母與Pichiaanomala組合更適合生姜梨酒的發酵。

2.3 不同酵母對生姜梨酒風味物質的影響

香氣成分是果酒優劣的關鍵因素，本試驗對單一酵母發酵和復合酵母發酵的果酒樣品進行GC-MS分析，根據色譜的百分比報告和譜庫檢索報告分析，11種酒樣的香味物質對比結果見表2所示。

由表2物質成分結果發現：11種酒樣中的揮發性香氣物質成分種類大致相似，共測出35種香氣物質，分別為醇類10種、酯類12種，萜烯類12種、苯酚類1種。11種酒樣中共有物質有7種，分別為苯乙醇、D-香茅醇、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯等。

2.3.1 醇類物質分析比較

醇類物質共檢測出10種(不計乙醇)，主要有異戊醇、異丁醇、苯乙醇等。11種酒樣醇類物質種類分別為3、6、2、3、6、6、5、3、4、4、7種，占總含量的11.24%、13.26%、2.91%、21.22%、15.94%、16.03%、12.92%、21.25%、13.76%、16.08%、15.00%，其中共有的醇類為異丁醇、苯乙醇。

注：“-”表示未檢出。

醇類主要來自于發酵過程中酵母代謝產生、其次也來源于糖苷類前體和酯類分解等[17]。在11種酒樣中，不同酵母發酵結果顯示，11種梨酒中異戊醇和苯乙醇含量最多，二者的含量占總醇類(除乙醇外)含量的72.0%～96.5%構成酒體主要香氣，與周雪艷等[18]研究發現，梨果酒中檢出香氣成分中，含量最高的成分為異戊醇、苯乙醇一致。異戊醇，具有水果香和花香，是酵母代謝的產物。苯乙醇具有玫瑰的香氣[19]，有一定的殺菌作用，給人以柔和愉悅的感受，顯示了異戊醇和苯乙醇是生姜果酒中的主要風味之一。其中B+D酒樣中苯乙醇相對含量最高達10.71%，單菌發酵D酒樣達6.62%，可能是Pichiaanomala優產苯乙醇。異丁醇具有刺激性的氣味，隨著濃度的增高對眼睛皮膚、黏膜和上呼吸道的刺激作用越大，安琪果酒酵母產異丁醇相對含量較高。正己醇等醇類也能賦予酒特殊香氣，且高級醇也是某些酯類物質的前體物質增加了生姜梨酒后發酵時期形成的酯類種類，對呈香有重要作用，能夠提高酒的感官品質。且D酒樣和B+D酒樣的總醇類物質較多，達21.25%,其酵母適合發酵稍高酒度的果酒。E+D酒樣中醇類香氣物質種類最為豐富，達7種，且2個酵母復配產生了新的香味物質Α-畢橙茄醇，增加梨酒香味物質成分，為生姜梨酒提供棉厚感。

2.3.2 酯類物質分析比較

酯類物質共檢測出12種，主要有辛酸乙酯、正己酸乙酯等。11種酒樣酯類物質種類分別為7、7、6、7、6、7、6、9、7、6、10種，占7.61%、7.93%、6.05%、8.70%、9.63%、5.90%、6.27%、10.97%、5.68%、2.70%、4.34%。其中共有的酯類有辛酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯、葵酸乙酯。

揮發性酯是組成香氣化合物的最重要種類，它們賦予葡萄酒和其他發酵飲料主要的水果香氣[20]。大多數酯類具有花、果香氣，在酵母代謝產生的揮發性物質中，酯對酒的風味貢獻最大[21]。酯類主要有辛酸乙酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯等。在11種酒樣中，辛酸乙酯相對含量最高，具有白蘭地酒的茴香味，與李麗梅等[22]報道辛酸乙酯是梨的特征芳香成分相一致。同時，具有似葡萄酒香和白蘭地香氣的癸酸乙酯[23]和具有曲香、菠蘿香的正己酸乙酯[24]相對含量也很高，使酒聞起來更濃郁；乙酸己酯有梨和獼猴桃香氣，有似梨的酸甜味，貢獻于生姜梨酒香氣的形成。釀酒過程中酯類香氣的形成與酵母菌的酯酶或醇酰基轉移酶有關，含量最豐富的是乙酸酯，其次是飽和脂肪酸乙酯[25]，而本試驗中作為飽和脂肪酸乙酯的辛酸乙酯含量最高，可能與釀酒酵母細胞內的EHT1 和EEB1 基因編碼醇酰基轉移酶過量表達有關[26-27]。

其中E+D酒樣中的酯類香氣物質種類最為豐富，達10種。且2個酵母復配產生了新的香味物質乙酸香葉酯(0.08%)和乙酸苯乙酯(0.32%)，乙酸香葉酯清甜而柔和[28]，似有玫瑰、香檸檬、薰衣草的香氣，增加生姜梨酒香味物質成分；乙酸苯乙酯，類似蘋果、桃子的果香及威士忌樣的香韻，適當含量可以緩解苯乙醇給梨酒帶來的悶香感。

2.3.3 萜烯類物質分析比較

萜烯類物質主要表現出果實的品種[29]。在11種酒樣中，萜烯類物質共檢測出12種，主要的化合物有D-香茅醇[30](玫瑰香氣)、橙花醇[31](玫瑰香氣)。11種酒樣萜烯類物質種類分別為5、4、6、7、3、6、8、2、4、7、9種，占2.33%、2.85%、4.74%、3.70%、1.11%、9.52%、7.22%、2.40%、2.99%、2.85%、2.70%，共僅有D-香茅醇，分別占總香氣成分的1.56%、1.87%、2.92%、2.68%、0.53%、3.86%、2.82%、2.25%、1.05%、0.96%、1.05%，作為葡萄酒中的特有的香氣成分特征，在生姜梨酒中也是一種香氣特征，但因為D-香茅醇香氣含量不一致而形成各自的風味特點。

A+B組合酒樣和A+E組合酒樣中2-莰醇(過敏、刺激、可引起頭痛等)含量較高，但單一的Yeast-W2發酵并沒有2-莰醇產生，可能是釀酒Yeast-W2與產香酵母Yeast-全興5#、安琪果酒酵母共發酵促進了2-莰醇的生成。11種酒樣中，E+D酒樣中萜烯類香氣物質種類最為豐富，達9種，保留了生姜梨酒的典型性。

2.3.4 物質分析比較結果

從物質含量來看，與其他10個酒樣相比，D+E酒樣的香味物質最多，為28種，香型豐富，苯乙醇(玫瑰香)、辛酸乙酯(茴香)和異戊醇(微甜)構成酒體的主要香氣，輔以正己酸乙酯(菠蘿香)，癸酸乙酯(葡萄的水果香氣)。綜合香氣成分分析結果和味覺分析，D+E酒樣中生姜梨果酒香氣成分復合，各香氣物質共同作用增加香氣復雜性，達到平衡，賦予優雅和諧的香味，且高級醇含量及成分均多于其他酒樣，使果酒更加復雜、濃郁、醇厚，進一步證明了安琪果酒酵母與Pichiaanomala組合更適合生姜梨酒發酵。

2.4 驗證試驗結果

對比單一酵母發酵實驗和復合酵母發酵實驗，發現安琪果酒酵母與Pichiaanomala的組合對糖的代謝能力和酒精的轉化生成能力最強。驗證結果見圖6和圖7所示。

從圖6和圖7可以看出，酒精生成的趨勢與糖降解的趨勢相符，第7天接近發酵結束時的酒精度接近最高值，還原糖含量也基本穩定。發酵的前3 d，總酸含量一直呈上升趨勢，但隨著發酵繼續生成的有機酸被降解，總酸含量逐步降低，第4～6天總酸含量下降緩慢(P>0.05)。原因可能為發酵前期，酵母代謝產生有機酸，總酸含量增加，發酵后期，酵母菌的酒精發酵將有機酸降解為酒精等小分子物質，與張文文等[32]中不同菌種及其混合發酵方式下發酵液的總酸呈現相同的變化趨勢，在第2～3天上升至最高，然后緩慢下降。由圖6還可以看出，總酯的含量起伏都在前期有些波動，但在后面趨于穩定。

最終發酵得到的生姜梨酒酒精度為12.47%vol，還原糖3.14 g/L，總酸含量3.133 g/L，總酯含量0.442 g/L，結合感官分析結果，得到的酒體清澈透明、有光澤，呈米黃色或淺黃色，口感醇厚，純正柔和、綿軟爽口、爽怡醇厚，具有濃郁的梨果香及淡淡的生姜獨特香氣，且典型性比較明確。因此，安琪果酒酵母與Pichiaanomala組合能釀造出風味和品質更佳的生姜梨酒。

3 結論

本研究通過對5株釀酒酵母單菌發酵與復合發酵研制的生姜梨酒進行酒精度、還原糖、總酸、總酯等理化指標檢測和感官評定，同時采用GC-MS分析比較其風味成分，最終確定安琪果酒酵母與Pichiaanomala為釀制生姜梨酒的最優酵母組合，研制所得生姜梨酒酒精度為12.47%vol，還原糖3.14 g/L，總酸含量3.133 g/L，總酯含量0.442 g/L，GC-MS檢測不同釀酒酵母發酵的生姜梨酒中含有35種香味物質，主體香氣成分有辛酸乙酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、異戊醇、苯乙醇等，各種香氣成分之間的相互協調，賦予了生姜梨酒的獨特風味，得到的酒體澄清，色澤淺黃有光澤，果香純正，口感甜美醇厚，具有濃郁的梨果香和淡淡的生姜香，典型性比較明確。

本文通過不同酵母菌對生姜梨酒發酵和風味的影響研究，確定釀制生姜梨酒的最優組合為Pichiaanomala和安琪果酒酵母，豐富果酒種類，結合研發需求，為新生代果酒-生姜梨酒的開發提供理論依據，以期今后對生姜梨酒的關鍵技術和瓶頸技術研究攻關，穩步提升新生代果酒發展質量，進一步增強果酒市場的核心競爭力。