即食食品中單增李斯特氏菌快速檢測技術的研究進展

尤禎丹,陳傳君,蔣玉涵,蒲春如,蔣 艷,杜娟蘭,張白玉,嚴立恒,顏其貴,韓國全,*

(1.四川農業大學食品學院,四川雅安 625014; 2.四川農業大學食品加工與安全研究所,四川雅安 625014; 3.四川農業大學動物醫學院,四川成都 611130)

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一種人畜共患病原菌,感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多,也可導致孕婦流產、胎死宮內、新生兒死亡等[1-3]。該菌廣泛存在于自然界中,對環境條件要求不高,是即食食品(Ready-to-eat,RTE)中威脅人類健康的主要病原菌之一[4]。因此,在食品微生物檢驗中必須加以重視。

即食食品由于其產品特性,該類食品很容易因為交叉污染等因素導致食源性病原菌的侵入。Iannetti等[5]收集了意大利不同類型的RTE產品,對2696個樣本進行綜合調查,包括軟、半軟干酪和熟肉制品,結果熟肉制品在實驗室樣品到達時污染率為1.66%,貨架期結束時污染率為1.92%;干酪到達實驗室時污染率為2.13%,貨架期結束時為1.01%。Mehmeti等[6]檢測了科索沃的產散裝奶的牧場,從10個不同地區分布的221個農場共采集了603個儲奶罐樣本進行牛奶質量評估,單增李斯特菌污染率為2.7%,且所有檢測出的菌株中毒力基因prfA、actA和hlyA均為陽性。近年來研究人員調查結果表明該菌在我國RTE食品中污染率在1%～10%,其中熟肉制品和涼拌菜污染率較高[7-11]。

與其他國家進行的調查相比,我國RTE食品中單增李斯特氏菌的流行率普遍相當。由于單增李斯特氏菌的危害性較大,對其有效且快速的檢測至關重要,本文對近期研究出來的檢測方法(分子生物學檢測技術、免疫學檢測技術、生物傳感檢測技術、光譜學檢測技術等)進行闡述,為相關工作者后期開發更高效、快速、準確、便捷的檢測方法提供新方向。

1 分子生物學檢測技術

1.1 結合等溫擴增技術

等溫擴增是在等溫條件下擴增靶核酸的方法,是一種快速、特異和敏感的方法,不需要昂貴的儀器,因此適用于資源不足的情況下的現場檢測。Yan等[12]直接使用細菌培養物或菌落作為模板,在環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)之前沒有任何DNA提取和純化,針對毒力基因hlyA設計引物,包括正向和反向內部引物、外部引物和環狀引物,反應過程和結果觀察在內的總檢測時間約為60 min,結果可視便于觀察。

如今產物檢測方式從電泳判定、濁度儀判定、目視濁度等方法向與傳感器結合判定改變,結果可更加準確、直觀。李秀梅等[13]針對hlyA基因設計了4條特異性引物和1條異硫氰酸熒光素標記的探針,與橫向流動試紙條技術(Lateral flow dipstick,LFD)聯合應用,對反應引物進行熒光標記,反應產物在橫向流動試紙條上完成顯色和結果判讀,該方法完成檢測全過程僅需80 min,對純細菌培養物的檢測靈敏度為3.6 CFU/mL。黃夢琪等[14]構建了一種基于滾環擴增技術的紙基顯色傳感器用于可視化致病菌的檢測平臺,將酶切后的單鏈產物不經過預變性雜交,直接進行試紙條檢測,在優化條件下檢出限為100 pg/μL,整個試驗過程可在幾小時內完成。Wachiralurpan等[15]建立了新的LAMP-LFD方法,在90 min內得到結果,使用純化的基因組DNA或來自純培養物的細胞的測定的檢測限分別為800 fg和2.82 CFU/mL,特異性試驗表明該方法與四種李斯特氏菌及12種非李斯特菌屬無交叉反應。Gao等[16]研究了一種重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification,RPA)結合LFD,優化了引物和探針,檢測時特異性高,整個分析從樣品預處理到最終結果大約30 min。Wang等[17]使用多重交叉位移擴增(Multiple cross-displacement amplification,MCDA)標記金納米粒子結合LFD,整個過程在1 h內完成,由于無需電泳、特殊試劑和檢測儀器,溫度控制在60～67 ℃即可,檢測結果可以通過肉眼直接觀察到,十分便捷。

1.2 結合聚合酶鏈式反應技術

有學者從提高細菌富集效率著手,采用不同納米顆粒進行富集,可不同程度縮短檢測時間。該方法反應時間較短,結果較為準確,靈敏度高,可同時檢測多種病原菌,但是反應結束后還需與其他技術相結合來觀測結果。Meng等[18]將萬古霉素(Vancomycin,Van)固定在聚乙二醇納米顆粒的表面可提高低濃度靶細菌的富集效率,而后與聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)結合檢測,該方法的檢出限為30 CFU/mL或g,總體測定時間不到4 h。Yang等[19]使用多價刷狀磁性納米探針對病原菌進行富集,該探針以聚L-賴氨酸、修飾胺基、萬古霉素為骨架,可在2 min內產生高濃縮效率(>94%),結合PCR-電化學發光分析,該方法下可以在低至10 CFU/mL的水平下快速準確檢測。

還有可以從特異性引物入手,結合不同種PCR技術同時對多種病原菌進行檢測。Phraephaisarn等[20]提出基于編碼兩種假設蛋白的基因設計的特異性引物BE-Lis,與PCR擴增結合用于所有李斯特氏菌屬物種的早期檢測。Wang等[21]研究出基于金納米粒子的常規寡核苷酸微陣列分析結合了金納米粒子的多重寡核苷酸連接-PCR和銀增強檢測技術,該檢測方法可以明確區分單一或多重感染八種病原菌,純培養物的檢測靈敏度為3.3～85 CFU/mL。Tao等[22]基于新型靶基因的多重PCR檢測能夠快速檢測李斯特氏菌屬,該方法的總檢測時間短至16 h。Ding等[23]研究開發了新型多重實時PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)技術,在DNA提取和培養之前添加了富集步驟,相比于傳統qPCR可降低檢測限和檢測時間,檢測限為14 CFU/25 mL。Feng等[24]研發了新型雙過濾基單疊氮丙啶(PMA)-多重PCR檢測方法,該檢測方法和濾膜法結合提高了LM的檢測成功率,檢測時間大約在6h左右。Witte等[25]評估了微滴式數字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)的實際應用,使用ddPCR從純的細菌培養物,人工污染的奶酪和天然污染的食物定量LM在相對寬的動態范圍內的結果是可靠的。Cremonesi等[26]用ddPCR系統的性能與qPCR平行測試進行比較,它靈敏度更高,在食品基質中對于李斯特氏菌屬物種測定為102CFU/g,檢測時不需要預擴增步驟,并且比qPCR顯示更高的精確度、靈敏度和可重復性,但是更加昂貴。Zeng等[27]用生物染料如單疊氮乙錠和PMA在DNA提取前對樣品進行預處理,與qPCR相結合,結果表明PMA-qPCR可用于定量測定LM的活細胞,其中死細胞與活細胞的比例不超過104,活細胞的濃度不低于103CFU/mL。qPCR、ddPCR等新型技術結果更加精準,靈敏度更高,檢測結果可直接顯示,更加方便快捷,但是儀器昂貴,成本較高。

2 免疫學檢測技術

除了從病原菌的核酸角度分析之外還從病原菌所特有的蛋白入手,結合免疫學方法進行檢測。現在更傾向于與層析試紙條技術相結合,結果觀測便捷。Wang等[28]提出了測定LM的側流免疫層析試紙條法,制備P60蛋白肽的單克隆抗體(mAb)1C1,并用金納米顆粒(Au Nanoparticles,AuNPs)標記,基于AuNP的條帶檢測可以檢測8種常見血清型的LM,檢測限為3.7×106CFU/mL,不與包括李斯特氏菌屬在內的其他細菌發生交叉反應。Tominaga[29]比較了基于膠體鈀納米顆粒(PdNPs)和AuNPs的橫流式試紙條測定法(Lateral flow test strip,LFTS)的靈敏度,PdNPs-辣根過氧化物結合LFTS法檢測LM的靈敏度是基于AuNPs-LFTS測定法的5～10倍。

還可以試開發新型抗體,再結合不同種檢測技術來進行試驗,一般檢測結果可直接觀察,成本較低,十分便捷。Morlay等[30]開發了一種新型抗體來聚集金和磁性納米顆粒,再通過表面增強拉曼散射(Surface enhanced raman scattering,SERS)檢測病原體,這種方法盡管需要在每次運行中添加納米顆粒,但在富集步驟成功地檢測了污染樣品,縮短了操作時間,檢測時間在25 h以內,同時對于任何革蘭氏陽性菌株或食物背景天然菌群沒有觀察到交叉反應。Liu等[31]開發了用于檢測LM夾心型的酶聯免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法,檢測的靈敏度為6.5 lg CFU/mL,可用作巴氏殺菌乳中該菌的快速檢測。林婷婷等[32]將該菌的單克隆抗體與磁性納米材料進行化學偶聯構建磁性納米探針,建立雙抗夾心模式的檢測試紙條,通過在層析體系中分別添加表面活性劑、鹽離子、雜蛋白和糖類,探討了其對層析的影響,減弱食品背景影響,提高了檢測的準確性和靈敏度。張賽等[33]以抗單增李斯特菌單克隆抗體偶聯磁珠制備免疫磁珠,示蹤物為熒光膠乳微球,再利用免疫熒光檢測儀檢測熒光信號,熒光免疫層析試紙條對純培養物的檢測限為4×105CFU/mL,人工污染樣品檢測限為1×104CFU/mL,試驗中未出現交叉反應。崔煥忠等[34]制備該菌的特異性單克隆抗體,研制膠體金試紙,對純培養物檢測的靈敏度為3.9×105CFU/mL。

3 生物傳感器檢測技術

生物傳感器是一種將生物活性信號轉換為電信號的裝置,主要有準確度高、分析速度快等特點,但是有時需自行設計大型儀器,難度較大。Wang等[35]結合了免疫磁珠分離、尿素酶催化和電化學阻抗分析,設計了一種新的等效電路模擬生物傳感器,該抗生物傳感器在3 h內可檢測到低至1.6×103CFU/mL的LM,適用于食源性病原菌的現場檢測。Sharma等[36]使用基于磁性隧道結的高度靈敏的生物傳感平臺檢測來自致病細菌的DNA,檢測LM的DNA靈敏度低于nmol/L范圍,具有很高的選擇性和特異性。Zhang等[37]建立了基于納米探針的生物傳感器,用Fe3O4納米粒子簇修飾的適配體作為信號放大納米探針,特異性識別該菌的細胞壁,與單獨的Fe3O4納米顆粒相比,粒子簇對顯色底物的顯色反應表現出集體效應增強的催化活性,吸光度或顏色的變化可以代表目標的濃度,方法可在5.4×103～108CFU/mL的線性范圍內直接測定。劉紅平等[38]基于SnO2納米粒子制備了LM特異檢測半導體氣體傳感器,響應和恢復時間分別在11、16s以內,初始接種量約為10 CFU/mL的LM在牛奶中培養12 h后也能被檢測出。Alhogail等[39]利用磁性納米粒子開發了新型LM的比色紙基生物傳感器,利用該菌產生的蛋白酶作為檢測致病菌的生物標志物,檢測限在30 s內為2.1×102CFU/mL,已經測試了傳感器的特異性,效果較為理想。

4 光譜學檢測技術

光學檢測方法一般無需特別復雜的前處理,即可檢測到其分布狀態,該類檢測方法一般有重復性較高、信號精度高等特點。基于振動光譜的檢測技術,表面增強拉曼散射(SERS)光譜技術被認為是一種快速、可靠、高度敏感的細菌檢測工具。Liu等[40]開發了一種SERS-LFD技術,再結合RPA檢測LM,檢測限為19 CFU/mL。Witkowska等[41]將SERS與主成分分析結合來檢測和鑒定LM,檢測和鑒定的整個過程(根據路徑I)需要7 d;另外兩條路徑,檢測過程分別簡化為2和3 d,雖然只有48 h,但只有98%的準確性。Donoso等[42]開發了一種新型的納米雜化化合物用于光學檢測LM,可以觀察到活性LM的熒光顯微鏡檢測濃度為5.19×103CFU/mL,納米雜合體對于該菌也是特異性的。Lu等[43]提出了一種新型便攜式高度自動化的熒光檢測儀器,該系統是由商用現成的光學元件構成的,用于收集光信號而自行設計的機械單元則作為驅動硬件的電源,該系統利用發光二極管激發熒光標記,光譜儀記錄來自樣品的熒光信號,能夠在每次檢測中最多自動測量十個樣品,檢測限在102～103CFU/mL。此類方法精度高,重復性好,但是所需檢測儀器價格較貴,每次檢測數量普遍有限。

5 其他檢測技術

除了基于核酸檢測、特有蛋白檢測之外,還可以與色譜、核磁等多項技術技術相結合對LM進行檢測。Sun等[44]開發了一種基于多重PCR與高效液相色譜法結合檢測方法,用于高通量篩查食源性病原菌,對于純培養物檢測限為約10 CFU/mL,在污染的食品基質中少于102CFU/g,雖然需要昂貴的設備,但能在1 h內完成約400個PCR樣品的信號檢測且成本不超過10元。陶珊珊[45]偶聯上LM的氧化錳納米粒子能夠特異性識別LM,并結合核磁共振技術,該方法檢測的線性范圍為10～103CFU/mL。范龍興等[46]將磁分離技術、免疫分析技術和化學發光檢測技術相結合,整個試驗在37 ℃條件下進行,3～4 h即可完成檢測,試驗操作較為簡便,檢測限可達10 CFU/mL,交叉反應率極低。Zhao等[47]基于LM與抗體修飾納米顆粒之間特異性結合所誘導的生物功能化磁性納米顆粒的聚集,結合核磁共振技術開發了一種可靠的檢測方法,官能化的Fe/Fe3O4納米顆粒對其他干擾性細菌的存在具有高特異性,該方法的檢測下限為3 MPN,檢測上限為103CFU/mL,但是這種方法不適合檢測可能含有LM的基質高于103CFU/mL,整個檢測時間在40 min內完成,總成本低于250元/樣。一些正在開發的生物傳感器或納米傳感器技術可在幾個小時內完成病原菌的快速檢測,這是一個新興的研發領域,快速、準確、便攜也是未來檢測技術的發展方向[48-50]。

6 結論

如今RTE種類越來越豐富,人們需求量也逐漸增大,因此為保證食品安全,研究人員對食源性致病菌的檢測顯得尤為重要。已有學者研發出不同的檢測技術,有的將幾種技術相結合來提高效率,有利于控制病原菌的傳播與污染。新興的生物識別轉導技術提供了開發小型、快速、無線傳感器的新思路,可用于增加病原菌監測的分辨率來確保食品的安全性,期待這些技術的應用日趨成熟,以滿足監管機構和消費者對食品質量與安全的要求。