新疆伊犁牧區傳統手工奶酪中微生物多樣性及其功能分析

王春艷，李宇輝*，李應彪,*，李寶坤，王騰斌，石秀如

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003；2.新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆 石河子 832000）

新疆奶酪又稱為奶疙瘩，是哈薩克族、蒙古族等少數民族喜歡食用的一種乳制品，哈薩克語稱奶疙瘩為庫魯特（Kurut）[1]。Kurut的生產環境與波蘭奶酪[2]非常相似，通常不使用發酵劑，僅由牛奶本身和環境中存在的微生物群通過自然發酵形成[3]。隨著便攜方便食品種類的日益豐富以及現代化生活方式不斷方牧區滲透，使得傳統奶酪的種類和加工量不斷減少，其中蘊藏的微生物資源也逐漸消失。因此，對傳統奶酪中微生物多樣性的研究將有助于保護其中的微生物資源。

奶酪營養價值極高，但我國居民對奶酪、黃油等高附加值乳品消費極少[4]，主要原因之一為奶酪的感官品質較差[5]。眾多研究發現，奶酪中的微生物主要包括乳酸菌[6-8]、酵母菌[9]以及霉菌[10-11]等三大類群，其中乳酸菌對奶酪感官品質的改善發揮著重要作用。有研究表明，乳酸菌在奶酪發酵初期產生的酸性物質有利于奶酪凝固[12]，并能促進干酪的成熟，提高干酪營養及強化風味物質的產生[13]。此外，乳酸菌在改善奶酪質地、拉伸性、氣孔形成以及抑制病原微生物生長等方面也發揮著重要作用[14-15]。除乳酸菌之外，奶酪中含有的其他細菌微生物群如丙酸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌、哈夫尼菌以及某些需氧放線菌等也有助于奶酪風味和顏色的形成[16-17]。高通量測序技術作為近年來新興的分子生物學技術，已被廣泛應用于土壤、食品及動物腸道等樣本微生物多樣性的研究[18]，它能夠對樣品中復雜和低豐度的微生物群落進行全面覆蓋，在屬甚至種水平上分析微生物群落多樣性[19]；而傳統培養法作為微生物鑒定的經典方法，可將分離出的微生物進行后續研究及應用。

伊犁傳統奶酪屬于自然發酵乳制品，其中蘊含的微生物種類繁多，目前采用高通量測序技術結合傳統培養的方法研究奶酪中微生物多樣性的報道相對較少[20]，且很少有人對伊犁牧區手工奶酪中的微生物進行研究。因此，本研究在采用Illumina MiSeq高通量測序技術對奶酪中細菌多樣性進行分析的基礎上，結合傳統培養法對奶酪中的乳酸菌進行分離鑒定，并根據其16S rRNA基因序列對其進行功能預測分析，旨在探明伊犁地區傳統奶酪中微生物種類及其基因功能信息，為挖掘和保護其中的微生物資源提供保障，同時為評估傳統奶酪的發全性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

14 種奶酪樣品分別采自新疆阿勒泰、北屯及額敏地區的牧民家，樣品經無菌采樣袋密封好后用4 ℃便捷式冰箱立即運往實驗室貯存于-20 ℃冰箱，在24 h內進行實驗。阿勒泰地區的奶酪樣品編號為B6、B7、T1及T2，北屯地區的奶酪樣品編號為B1、B2、B3及B4，額敏地區的樣品編號為E1、E2、E3、E4、E5及E6。

MRS培養基、營養明膠培養基、醋酸鉛培養基、硝酸鹽培養基、半固體瓊脂培養基 青島海博生物技術有限公司；細菌DNA提取試劑盒 美國Biomiga公司；2×Taq Master Mix (Dye Plus) 南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖 莫班牙Biowest公司；Magnetic Soil And Stool DNA Kit試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

22331型高速冷凍離心機 德國Eppendorf AG公司；HP1020凝膠成像系統、T100型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；CX23LEDRFS1C生物顯微鏡 奧林巴斯（廣州）工業有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申發醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 細菌多樣性分析

采用Magnetic Soil And Stool DNA Kit試劑盒提取樣品總DNA，每個樣品3 個平行，利用NanoDrop2000型微量紫外分光光度計檢測DNA的濃度及純度。PCR擴增引物為：27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和533R（5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’），PCR體系為：4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL Forward Primer（5 μmol/L），0.8 μL Reverse Primer（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μL BSA，10 ng Template DNA補dd H2O至20 μL。程序如下：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環數為27，72 ℃最終延伸10 min。擴增結束后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物的純度。使用凝膠回回試劑盒切膠回回PCR產物進行文庫構建后，在Illumina MiSeq PE 300平臺上進行高通量測序分析。參照田建軍等[21]的方法進行數據分析及繪圖，并運用PICRUSt軟件對樣品中的微生物進行16S rRNA功能預測分析。

1.3.2 乳酸菌多樣性分析

1.3.2.1 菌株的分離、純化

將奶酪置于無菌條件下用研缽將樣品充分研碎并混勻，取適量研碎的樣品置于50 mL MRS液體培養基中進行擴增培養，37 ℃培養24 h。吸取1 mL擴增培養液用生理鹽水進行10 倍梯度稀釋，每次稀釋均需用移液槍把液體充分混勻并更換無菌槍頭。分別吸取10-3～10-5梯度的稀釋液100 μL稀釋液均勻涂布于MRS培養基中，每個梯度做4 個平行，于37 ℃恒溫培養箱中培養48 h。挑取不同形態的菌落進行劃線培養，重復劃線多次，直至用顯微鏡觀察至純種，記錄其菌落、細胞形態。將純化后的乳酸菌用50%甘油-菌液（1∶1，V/V）于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.2.2 生理生化實驗鑒定

樣品中乳酸菌的生理生化鑒定實驗按照文獻[22-23]的方法，包括：菌落及細胞形態的觀察、過氧化氫實驗、革蘭染色實驗、明膠液化實驗、硫化氫實驗、硝酸鹽還原實驗、運動性實驗、耐鹽性實驗、pH 4.5生長實驗以及糖發酵實驗。

1.3.2.3 16S rDNA測序鑒定

采用美國Biomiga公司的細菌gDNA提取試劑盒分離菌株基因組DNA，具體步驟按照說明書進行，使用微量核酸定量儀檢測基因組D N A濃度以及純度（OD260nm/OD280nm）。擴增引物為27F（5’-AGAGTTTGATMTGGCTCAG-3’），1492R（5’- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR擴增體系（50 μL）及條件：上下游引物各2.0 μL，模板2.0 μL，2×TaqMaster Mix 25 μL，Nuclease-free Water 19 μL。PCR擴增循環參數為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環30 次，72 ℃最終延伸5 min，-20 ℃保存。取5 μL的PCR產物加入到1%的瓊脂糖凝膠（含0.01%的goldviewII型核酸染色劑）點樣孔中，在電壓100 V、電流90 mA、電泳液為1×TAE緩沖液中電泳40 min。將符合測序要求的PCR產物寄往測序公司進行測序操作，所得序列在NCBI中進行BLAST比對，將測序菌株與模式菌株同源性大于99%的序列利用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹，數據自展重抽樣次數1 000 次。

2 結果與分析

2.1 奶酪中細菌多樣性分析

2.1.1 細菌序列信息及α多樣性

常用到的α多樣性指數包括豐富度指數（Sobs指數、Chao1指數）、多樣性指數（Simpson指數、Shannon指數）以及群落覆蓋度指數Coverage等[24]。本研究中所得到的奶酪樣品序列信息及α多樣性指數如表1所示，14 份奶酪樣品共得到的細菌原始序列為561 955 條，質控過濾后得到的有效序列為545 560 條。在物種豐度上，阿勒泰地區T2樣品的Sobs和Chao1指數最大，說明其細菌數目最多，且與其他樣品差異顯著；阿勒泰地區B7和額敏地區E2樣品的Sobs和Chao1指數較小，其細菌數目較少，B7與E2樣品的Sobs指數無顯著差異，但其Chao1指數存在顯著差異。在物種多樣性上，樣品T2的Simpson指數最小，Shannon指數最大，說明其細菌多樣性最高，且與其他樣品有顯著差異；樣品B7的Simpson指數最大，Shannon指數最小，說明其細菌多樣性最低。14 份樣品的Coverage指數均接近于1，說明樣品中的序列基本都被完全測出，測序結果能夠充分反映樣品中的細菌多樣性，但B7樣品的Coverage指數與其他樣品差異顯著。

表1 14 份奶酪樣品的序列信息及α多樣性指數Table 1 Sequence information and α diversity values of 14 traditional cheeses samples

2.1.2 細菌群落結構分析

圖1 屬（a）和種（b）水平下的細菌群落組成Fig. 1 Relative abundance of bacteria at genus (a) and species (b) levels from all cheese samples

在細菌屬水平上（圖1a），14 份奶酪共測出29 種相對豐度大于2%的屬，相對豐度排名前10的細菌屬依次雷爾氏菌屬（Ralstoniaspp. 30.41%）、乳桿菌屬（Lactobacillusspp. 9.17%）、葡萄球菌屬（Staphylococcusspp. 6.32%）、不動桿菌屬（Acinetobacterspp.4.62%）、醋酸桿菌屬（Acetobacterspp. 3.98%）、腸球菌屬（Enterococcusspp. 3.15%）、厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillusspp. 2.96%）、志賀氏菌屬（Escherichia-Shigellaspp. 2.92%）、norank_c__Cyanobacteria（2.67%）、鏈球菌屬（Streptococcusspp.2.61%），這與Dalmasso等[25]報道的Ralstoniaspp.在奶酪中并不常見或者含量極低（0.01%～0.000 1%）的結果并不一致。目前，關于Ralstoniaspp.在食品中存在的報道并不多，Soto等[26]利用高通量測序技術研究驢奶中的細菌多樣性時，發現其中的優勢細菌屬為Pseudomonasspp.、Ralstoniaspp.、Acinetobacterspp.，由于伊犁傳統手工奶酪制作過程中沒有添加外源發酵劑，因此考慮奶酪中的Ralstoniaspp.可能來源于原料乳。Selvasankar等[27]利用高通量測序技術分析了墨莫哥奶酪中的細菌群落，結果發現Streptococcusspp.、Lactococcusspp.、Lactobacillusspp.、Aerococcusspp.和Weisellaspp.是主要菌群，本研究與其相同之處在于奶酪中均存在Streptococcusspp.、Lactobacillusspp.、Weisellaspp.、Lactococcusspp.，而未發現Aerococcusspp.；這說明上述共同菌群是大部分傳統手工奶酪中的常見菌種，但由于制作手法及氣候條件的不同可能會導致奶酪中的微生物群落結構有所差異。

在細菌種水平上（圖1b），14 份奶酪共測出39 種相對豐度大于2%的種，大部分都屬于unidentified（24.38%）、unclassified（16.75%）和uncultured（10.63%），能準確鑒定到種的只有瑞士乳桿菌（L. helveticus3.06%）、蘋果醋桿菌（Acetobacter malorum3.01%）、大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli2.97%）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis1.64%）、Halomonas desiderata（1.54%）、埃氏慢生根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii1.38%）、皮特不動桿菌（Acinetobacter pittii1.33%）、產堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes1.18%）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus1.01%）、瓊氏不動桿菌（Acinetobacter junii0.71%）、赫曼尼腸球菌（Enterococcus hermanniensis0.4%）、Acinetobacter tandoii（0.21%）。HTS結果顯示出奶酪樣品中的優勢乳酸菌種為L.helveticus，且大部分存在于額敏地區的E1樣品中，說明不同地區或不同樣品中的優勢菌種存在明顯差異[28]。本研究結果顯示出Illumina MiSeq測序技術在種水平上的鑒定能力較差，無法將大多數微生物鑒定到種水平，這與陳澤斌等[29]的描述結果一致。

2.1.3 不同樣品細菌群落組成差異

圖2 基于Weighted UniFrac的不同樣品PCoA圖（a）及樣本菌群分型分析圖（b）Fig. 2 PCoA plot (a) and bacterial classification plot (b) of cheese samples at genus level based on weighted UniFrac

14 份奶酪樣品盡管其原材料均為牛奶且制作過程中也均未添加任何外源發酵劑，但由于其制作工藝、生產溫度及奶源本身微生物種類的差異[30]等原因，14 份奶酪的細菌群落組成也會有所差異。從PCoA圖（圖2a）可以看出，14 份奶酪樣品的細菌群落組成大致可以分為2 個類型：其中B2、B3、E5和E6樣品在圖中的分布較為集中，說明這4 份樣品的細菌群落結構較為相似。結合圖1a可以看出，這4 個樣品都含有豐度較大的Ralstonia spp.，且其菌群組成及相對豐度差異也都較小。另外10 個樣品在圖中的分布較為分散，說明這10 個樣品的細菌群落結構差異較大。這10 個樣品中雖然B1、B6、E2、E3及E4樣品的優勢菌群均為Ralstonia spp.，B7和E1的優勢菌群為Lactobacillus spp.，但其他菌群組成及相對豐度差異較大；其余3 個樣品的優勢菌群不僅各有不同，而且其他菌群組成及相對豐度也都差異較大（圖1a）。

從樣本菌群分型分析圖（圖2b）可以看出，14 份奶酪樣品根據其菌群組成的不同可以分為2 個大型類群和6 個小型類群。2 個大型類群中B1、B2、B3、E3、E5及E6聚成了一個類群且于E4的距離較近，E2和B6聚成了另外一個類群但與B1形成的類群具有重疊之處。結合圖1可以看出，B1、B2、B3、B6、E2、E3、E4、E5及E6樣品中的優勢菌群均為Ralstonia，但B6和E2除含有豐富的Ralstonia，其余菌群組成和豐度都與其他樣品存在差異，故E4與B1形成的類群之間的距離較近，而B6與E2單獨形成了一個類群。其余5 個樣品形成的5 個單獨類群不僅優勢菌群各不相同而且菌群組成差異較大，故在圖中各自形成了單獨類群且距離較遠。

2.1.4 不同地區樣品細菌種類差異分析

不同地區樣品中的微生物組成會隨著地域環境及樣品制作方法的不同而有所差異[31]。本研究利用Venn圖對3 個地區樣品中所含有的微生物種類在屬和種水平上進行比較分析，結果顯示不同地區樣品中存在的微生物種類差異較為明顯。在細菌屬水平上（圖3a），額敏、阿勒泰和北屯3 個地區14 份樣品中所含有的細菌總數為493 種，其中3 個地區特有的細菌種數依次為62、171、60 種，共有的細菌種數為100 種，占細菌總數的12.6%。在細菌種水平上（圖3b），3 個地區所含有的細菌總數為780 種，其中額敏、阿勒泰和北屯地區特有的乳酸菌種類依次為102、320、124 種。綜上可知，在屬和種兩個分類學水平上，阿勒泰地區奶酪中的微生物種類最為豐富，而額敏地區奶酪中的微生物種類較少。Jin Hao等[32]利用PacBio測序技術研究了來自Buryatian 7 份手工奶酪中的細菌多樣性，結果顯示7 份奶酪共存在82 個細菌屬和145 個細菌種，優勢細菌屬為Lactococcus（51.46%）和Streptococcus（17.81%），這與本研究結果不同，本研究結果揭示了伊犁手工奶酪中的微生物群落組成更為復雜，其原因可能是伊犁手工奶酪生產環境中的微生物群落較為復雜[33]且這些微生物也適于在奶酪中生存。

圖3 不同地區樣品在屬（a）和種（b）水平下細菌種類Fig. 3 Bacterial species at genus (a) and species (b) levels in samples from different regions

2.2 乳酸菌多樣性分析

2.2.1 乳酸菌形態學觀察

從MRS培養基中分離出68 株疑似乳酸菌，其中有20 株球菌（29.4%）、48 株桿菌（70.6%）。在MRS固體培養基上為乳白色或微黃色，部分透明，邊緣規則或齒狀，圓形隆起或扁平且大部分表面光滑。革蘭染色發現均為陽性、過氧化氫均為陰性，細胞形態為球狀或桿狀，呈單個、成對或鏈狀排列（圖4）。

圖4 不同乳酸菌的菌落形態（a）及革蘭染色后的細胞形態（b）Fig. 4 Colony morphology (a) and cell morphology (b) of different lactic acid bacterial strains

2.2.2 乳酸菌的生理生化鑒定及16S rRNA基因同源性分析

如表2所示，68 株乳酸菌均為革蘭氏陽性、過氧化氫陰性菌，能在pH 4.5、0% NaCl、4.5% NaCl和6.5% NaCl的環境中生長，能發酵葡萄糖、麥芽糖；都不能液化明膠、不能還原硝酸鹽、無運動性、不能在10% NaCl、無碳源的環境中生長且不能利用淀粉作為碳源。在硫化氫實驗中，只有2 株融合魏斯氏菌（Weissella confusa）能夠產生硫化氫，使醋酸鉛培養基變成黑色。短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和大部分融合魏斯氏菌能夠發酵葡萄糖產氣，其余菌株能發酵葡萄糖但不產氣。在糖發酵實驗中，68 株乳酸菌中有2 株瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）不能利用七葉靈、核糖，2 株短乳桿菌不能利用半乳糖、1 株融合魏斯氏菌不能利用果糖。大多數菌株都能夠發酵苦杏仁苷、纖維二糖、甘露醇、乳糖、甘露糖、水楊苷、蔗糖、蕈糖、阿拉伯糖、糊精，不能發酵蜜二糖、山梨醇、松三糖、棉籽糖、木糖等。所有乳酸菌中瑞士乳桿菌能夠利用的糖類最少，植物乳桿菌能夠利用的糖類最多，其余菌種可利用的糖類也都有所差別。

表2 68 株乳酸菌的生理生化特性Table 2 Physical and chemical properties of lactic acid bacteria isolated from cheese samples

圖5 本研究分離的乳酸菌與相近類群的系統發育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria isolated in this study and their related groups

將68 株乳酸菌的16S rRNA基因序列輸入到在線的EzBioCloud數據庫中進行相似性搜索，以序列相似性大于等于98.7%為同種標準歸類，下載相似性最高的模式菌株序列與測序序列利用MEGA7.0軟件構建系統發育樹（圖5）。本研究根據16S rRNA基因序列鑒定結合生理生化實驗結果，將68 株乳酸菌歸為3 屬9 種，其中T2-2等32 株菌為融合魏斯氏菌、B4-4為耐久腸球菌（Enterococcus durans）、B4-5為鳥腸球菌（Enterococcus avium）、E1-5和E3-3為瑞士乳桿菌、B1-8等8 株菌為屎腸球菌（Enterococcus faecium）、B2-10等6 株菌為短乳桿菌、E6-2等8 株菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、B4-6為棉籽糖腸球菌（Enterococcus raffinosus）、B4-1等9 株菌為糞腸球菌（E. faecalis）。Domingos-Lopesa等[34]從Azores地區的12 份手工“Pico”奶酪中分離出了114 株乳酸菌，其中屬于Enterococcus和Lactobacillus屬的乳酸菌種類最為豐富，這與本研究的結果較為一致，其原因可能為本研究所選擇的手工奶酪與“Pico”奶酪均為手工制作且沒有添加任何外源發酵劑。

2.2.3 不同地區可培養乳酸菌差異分析

表3 不同地區分離到的乳酸菌信息統計Table 3 Statistics of lactic acid bacteria isolated from cheeses from different areas

從表3可以看出，北屯地區分離到的乳酸菌種類最為豐富，阿勒泰及額敏地區樣品中所含有的乳酸菌種類較為貧乏。3 個地區所分離到的乳酸菌種類各不相同，其中北屯地區的樣品中含有4 種特有乳酸菌（L. brevis、E. durans、E. avium、E. raffinosus），額敏地區的樣品中含有2 種特有乳酸菌（L. plantarum、L. helveticus），而阿勒泰地區的樣品中沒有獨特的乳酸菌種，可能是奶酪原料、成熟度、制作手法以及地理位置不同所致[28]。

2.3 不同方法在乳酸菌鑒定上的比較分析

利用Illumina MiSeq測序技術及傳統培養法對14 份奶酪中鑒定出的乳酸菌進行比較分析，可以看出兩種方法在乳酸菌的屬種鑒定上存在明顯差異（表4）。在屬水平上，Illumina MiSeq測序技術鑒定出了5 類乳酸菌，傳統培養法只分離出了3 類乳酸菌，但測序法未能鑒定出Weissella，傳統培養法未分離出Lactococcus及Streptococcus。其原因可能為本研究的測序結果只呈現出了相對豐度大于2%（圖1）的細菌屬，而Weissella在奶酪中的含量可能低于2%；傳統培養法由于人為去重及培養條件等原因僅能檢測到易培養及優勢菌的情況[35]，從而未能將奶酪中的乳酸菌進行全部分離。在種水平上，傳統培養法能夠鑒定出更多的乳酸菌，高通量測序技術由于在種水平上的鑒定能力較弱[36]，故鑒定出的乳酸菌種類較少。

表4 不同方法在屬和種水平上鑒定到的乳酸菌種類Table 4 Statistics of lactic acid bacteria identified by two different methods at genus and species levels

2.4 樣品微生物基因功能預測分析

圖6 COG功能預測分析圖Fig. 6 COG function prediction

奶酪中的細菌類型可以調節奶酪在成熟過程中的風味產生，并且與基因組編碼的代謝多樣性直接相關[37]。根據COG數據庫的信息，從eggNOG數據庫中解析到各個COG的描述信息及其功能信息，得到的功能預測豐度如圖6所示，14 份樣品得到的COG功能預測信息組成基本相同，但豐度差異比較明顯。奶酪中微生物一部分豐度較高的基因參與到未知功能和一般功能這兩個COG分類中，其余基因大多與氨基酸（9.35%）、碳水化合物（6.49%）和脂質（4.57%）代謝、轉錄（8.28%）以及能量轉換（6.86%）有關，這與前人的研究結果具有相似性，表明在奶酪微生物基因組中包含大量參與蛋白質與碳水化合物代謝有關的基因[38]，這些化合物的代謝必然伴隨著轉錄以及能量的產生與轉換，從而圖中也顯示出奶酪中含有較高豐度的與轉錄、能量轉換相關的基因。14 份樣品的微生物群落組成雖存在明顯差異（圖1），但每個樣品所具有的基因功能一致，只是豐度有所不同，其原因可能為不同菌群所具有的基因功能具有相似性[39-40]。

3 結 論

本研究采用分子生物學技術和傳統培養相結合的方法研究了新疆伊犁14 份傳統手工奶酪中的乳酸菌及細菌多樣性。高通量測序結果揭示Lactobacillus spp.為奶酪中的優勢乳酸菌屬且手工奶酪中還存在著一些植物性致病菌（如Ralstonia）和動物性致病菌（如Staphylococcus）；傳統培養法結果表明伊犁手工奶酪中的優勢乳酸菌種為W. confusa，優勢乳酸菌屬為Lactobacillus和Enterococcus。PICRUSt分析發現奶酪中菌群最主要的已知功能為氨基酸轉運與代謝，即奶酪中大部分細菌與氨基酸轉運蛋白及酶的生成有關，改變奶酪中的菌群結構可能會對這些代謝過程產生影響，從而影響奶酪的感官品質。高通量測序技術能將大多數微生物鑒定到“屬”的水平，無法將大多數微生物鑒定到“種”水平；而傳統培養結合生理生化及16S rRNA基因測序技術可將乳酸菌準確鑒定到種，但很難對樣品中的乳酸菌進行全面分離鑒定。因此，兩種方法的結合可以更全面地揭示奶酪中的微生物組成，為奶酪的工業化生產提供基礎數據，同時對16S rRNA序列進行功能預測分析有利于為今后研究菌群功能奠定理論基礎。