基于頂空氣相色譜-離子遷移譜技術的生咖啡豆快速鑒別方法

杜 萍，陳振佳*，楊 芳*，李曉蕾，楊 俊，劉春俠，梁靜思，任 芳

（1.昆明理工大學分析測試研究中心，云南省分析測試中心，云南 昆明 652094；2.中國咖啡工程研究中心，云南 德宏 678400；3.武漢工程大學環(huán)境生態(tài)與生物工程學院，湖北 武漢 430205；4.山東海能科學儀器有限公司，山東 德州 251500）

咖啡是茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea），熱帶常綠植物，為世界三大飲料之一[1-2]，也是中國主要熱帶經濟作物之一[3]。咖啡商品豆主要有阿拉比卡（Coffea arabica）、羅布斯塔（Coffea robusta）以及利比里亞（Coffea liberica）三大原種，在中國被定義為小粒、中粒和大粒種咖啡。目前，以這3 個原種進行研究開發(fā)，共衍生出100多種咖啡品種[4]。云南是中國最大的咖啡產區(qū)[5]，獨特的地理環(huán)境和立體式氣候造就了云南咖啡產業(yè)的蓬勃發(fā)展，其咖啡種植面積和咖啡豆產量均占國內99%以上。盡管中國已成為世界咖啡生產大國、貿易大國和消費大國之一，并保持快速增長的趨勢[6]，但還存在引種渠道不同、栽培變種繁多混雜以及形態(tài)認識不足等諸多問題[7]，這些差異對咖啡豆產品品質有顯著影響。例如，生咖啡豆中揮發(fā)性成分是咖啡豆產品風味物質表達的重要特征之一，但不同地理環(huán)境、不同品種的生咖啡豆內風味物質差異會影響咖啡豆產品的風味品質。目前，關于不同咖啡豆風味方面的研究主要集中在烘焙咖啡豆，如對咖啡豆烘焙過程中香氣物質及其變化規(guī)律的研究[8-10]。Wei Feifei[11]、Schramm[12]等采用核磁共振譜、單一光子離子化離子阱質譜等分析儀器對咖啡豆的烘焙過程中化學成分進行實時跟蹤分析。近年來，國內關于烘焙咖啡豆香氣成分的研究也在逐漸增加。周斌等[13]研究了不同產地咖啡豆香氣成分組成，王瑩等[14]研究了興隆咖啡烘焙過程中香氣物質的變化規(guī)律。然而，關于生咖啡豆揮發(fā)性成分研究較少。

目前，咖啡豆揮發(fā)性成分分析主要采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法以及電子鼻法。Aline等[15]采用頂空-固相微萃取結合氣相色譜-質譜法對巴莫生咖啡豆中的揮發(fā)性物質進行分析；也有報道采用頂空-固相微萃取結合氣相色譜-質譜法對中國產區(qū)生咖啡豆揮發(fā)性成分進行研究[16-18]。電子鼻技術可用于感知咖啡樣品因烘焙加工不同而引起的差異[14,19]，但存在傳感器重復性不好及不具備化合物準確定性分析的譜庫等問題。這些傳統(tǒng)檢測方法存在操作復雜、耗時長及數(shù)據(jù)分析專業(yè)性強等問題。

氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技術是近年出現(xiàn)的一種新的氣相色譜分離和檢測技術，完美結合了GC的分離能力和IMS快速響應、高靈敏度的優(yōu)勢[20]，無需樣品前處理、實現(xiàn)無損快速檢測，適合于揮發(fā)性成分的痕量探測，主要用于軍事[21]、環(huán)境空氣監(jiān)測[22]以及人體呼吸氣體痕量組分檢測[23]。近年來，GC-IMS在食品風味[24-28]、食品發(fā)全[29-32]等領域也有應用，主要集中在食用油、肉類、谷物、海鮮、蜂蜜、食用菌及乳制品方面，鮮見其應用于生咖啡豆的報道。

本實驗以云南不同品種的生咖啡豆為樣品，采用頂空-GC-IMS（headspace-GC-IMS，HS-GC-IMS）對19 種生咖啡豆的揮發(fā)性成分進行采集和分析。建立不同品種生咖啡豆揮發(fā)性風味物質指紋圖譜，根據(jù)揮發(fā)性成分數(shù)據(jù)差異性分析，對不同品種生咖啡豆進行區(qū)分，為咖啡豆無損分類識別、產地追溯、品質控制與評價方法提供了一定參考依據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

生咖啡豆由中國咖啡工程研究中心提供，德宏咖啡（云南德宏熱帶農業(yè)科學研究所），水洗加工處理得到生咖啡豆。19 個生咖啡豆樣品中，編號816為大粒種，編號LYL11為阿拉比卡小粒種，編號799～815為阿拉比卡小粒種的各栽培變種，均來自于云南德宏，具體信息見表1。

表1 19 個生咖啡豆樣品Table 1 Information about 19 samples of green coffee beans

1.2 儀器與設備

FlavourSpec?食品風味分析與質量控制系統(tǒng)（配有CTC自動頂空進樣器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及Library Search定性軟件的GC-IMS系統(tǒng)） 德國G.A.S公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-GC-IMS分析

采用快速、靈敏、無損的GC-IMS技術對生咖啡豆樣品品種進行揮發(fā)性成分的區(qū)分及鑒別。由于GC-IMS分析生咖啡豆揮發(fā)性的特征成分鮮有報道，為表達真實的狀態(tài)，檢測到低溫下易揮發(fā)的揮發(fā)性物質，采用顆粒無粉碎直接裝入樣品瓶。根據(jù)生咖啡豆特性、樣品瓶大小及均勻振蕩加熱的方式，選擇樣品量4.5 g、孵化溫度60 ℃、孵化時間10 min，因此與傳統(tǒng)氣相色譜-質譜的方法相比較，GC-IMS方法樣品處理及分析的溫度較低，能真實反映樣品原始的狀態(tài)。在正式測試樣品之前，19 批樣品中抽取3 批生豆篩選優(yōu)化實驗方法，觀察其代表性的峰高，最終確定分析方法。

1.3.2 HS進樣條件

孵化溫度60 ℃；孵化時間10.0 min；加熱方式：振蕩加熱；頂空進樣針溫度65 ℃；進樣量500.0 μL，不分流模式；載氣：高純氮氣（純度≥99.999%，推斷和清洗進樣針）；清洗時間0.50 min。

1.3.3 GC條件

FS-SE-54-CB-1石英毛細管柱（15 m×0.53 mm，0.5 μm）；色譜柱溫度40 ℃；載氣：高純N2（純度≥99.999%）；載氣流速程序：初始2.0 mL/min，保持2 min，8 min內線性增至100 mL/min，10 min內線性增至150 mL/min，運行時間20 min。

1.3.4 IMS條件

漂移管長度98 mm；管內線性電壓400 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣為N2（純度≥99.999%）；漂移氣流速150 mL/min；放射源：β射線（氚（3H））；離子化模式：正離子。

1.3.5 樣品測定

取4.5 g樣品，放入20 mL頂空進樣瓶中，60 ℃孵化10 min，通過頂空進樣用Flavour Spec?食品風味分析儀進行測試。經G.A.S.的功能軟件分析可給出樣品中揮發(fā)性有機物的差異譜圖、軟件內置的NIST數(shù)據(jù)庫及IMS數(shù)據(jù)庫可對物質進行定性分析。

2 結果與分析

2.1 生咖啡豆HS-GC-IMS譜圖分析

生咖啡豆化學組分復雜，大部分是形成烘焙咖啡產品特有風味的前體物質，其中揮發(fā)性成分是重要物質之一。生咖啡豆具有的揮發(fā)性成分直接影響烘焙咖啡產品的香氣形成。通過HS-GC-IMS對生咖啡豆揮發(fā)性成分進行無損分析，最大程度地表達樣品的指紋特征，確保樣品數(shù)據(jù)的全面性、真實性及溯源性。

圖1 生咖啡豆編號815（A）、816（B）、LYL-11（C）的GC-IMSFig. 1 GC-IMS topographic plots of green coffees 815 (A), 816 (B), and LYL-11 (C)

圖2 生咖啡豆樣品峰高差異（A）和編號815（B）、816（C）、LYL-11（D）的偽彩色對比圖Fig. 2 Comparison of peak heights (A) and pseudo color images of green coffees 815 (B), 816 (C), and LYL-11 (D)

采用HS-GC-IMS對19 個云南生咖啡豆進行揮發(fā)性成分差異分析，如圖1所示，整個譜圖代表了樣品頂空中所有揮發(fā)性成分。由于樣品數(shù)量多，選取代表性樣品，圖1中只顯示了編號815（C. arabica cv. Typica）、816（C. dewevrei cv. Excelsa）及LYL11（C. arabica）?？梢钥闯?，HS-GC-IMS首先對咖啡豆復雜的揮發(fā)性成分進行GC初步分離，不同保留時間流出的組分以氣態(tài)分子的形式進入IMS電離室，與逆方的漂移氣分子發(fā)生碰撞，由于組分離子在質量、碰撞截面和電荷數(shù)等因素上的差異進行了二次分離。通過獲取離子漂移時間和離子峰強度可分別對各組分進行定性和定量分析。每一個點代表一種揮發(fā)性成分。

為直觀清晰比較不同品種生咖啡豆樣品之間的差異，編號815的生咖啡豆以差譜偽彩色圖形顯示[33-34]，對比其與編號816和編號LYL11之間的差異。圖2中濃度相同的物質顏色抵消為白色。樣品中的藍色區(qū)域表示該物質濃度低于參比樣品，藍色越深，表示濃度越低；被參比樣品中的紅色區(qū)域表示該物質濃度高于參比樣品，紅色越深，表示濃度越高。從圖2可以看出，3 種生咖啡豆揮發(fā)性成分的濃度和種類差異很大，以所選峰為例如圖2紅圈所示，在3 個樣品中峰高的變化非常明顯，即使是屬于同一原種小粒種咖啡的815和LYL11，風味物質差異也較大。

2.2 生咖啡豆的HS-GC-IMS譜圖定性分析

根據(jù)揮發(fā)性成分GC保留時間和離子遷移時間對生咖啡豆揮發(fā)性組分進行定性分析，從19 個生咖啡豆樣品選取編號LY11的生咖啡豆樣品，共計檢測出137 種化學組分，通過內置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與IMS遷移時間數(shù)據(jù)庫進行二維定性，由于該數(shù)據(jù)庫在食品風味分析領域正處于擴展和完善中，因此確定了42 種揮發(fā)性物質的化學成分（表2）。這42 種物質主要是醛類、酯類、醇類、酮類、吡嗪類、酸類及含硫化合物，與咖啡揮發(fā)性成分組成的相關報道一致[16-17,35]。

表2 生咖啡豆揮發(fā)性成分的定性Table 2 Green coffee volatiles identi fied by HS-GC-IMS

續(xù)表2

2.3 生咖啡豆的HS-GC-IMS譜圖比較分析

圖3 19 個生咖啡豆樣品的指紋圖譜Fig. 3 Fingerprints of 19 samples of coffee green beans

為方便快速地對比不同樣品間揮發(fā)性有機物的差異，F(xiàn)lavourSpec?系統(tǒng)自帶LAV軟件內置的Gallery Plot插件，選取有明顯差異及變化規(guī)律的離子峰生成指紋圖譜。從圖3可以看出，紅色圈中是特征指紋峰的表達，其中編號LYL-11阿拉比卡小粒種、編號816大粒種和編號799～815阿拉比卡小粒種的各栽培變種3大類差異明顯，而編號799～815阿拉比卡小粒種的各栽培變種之間揮發(fā)性成分的差異相對較小，或許與其栽培變種系列有關，有待進一步研究。

圖4 不同品種生咖啡豆的指紋圖譜Fig. 4 Fingerprints of different varieties of coffee green beans

由于樣品數(shù)量多，信息量大，只選取編號816大粒種、編號LYL11阿拉比卡小粒種以及編號801、805、809、810、815的阿拉比卡小粒種的栽培變種進行揮發(fā)性化學成分的差異分析。如圖4所示，整個指紋圖譜中從上到下依次為801、805、809、810、815、816和LYL-11的測試樣品：紅色框中的揮發(fā)性物質分別是樣品801、809、810、815中含量較高的物質，分別為801樣品中的丁酸乙酯、3-羥基丁酮等；809樣品中的戊酸乙酯等；815樣品中的乙酸丙酯等；805樣品中沒有含量較高的特征物質；810樣品中有未鑒定出的含量較高的特征物質，但由于目前軟件內置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與G.A.S.的IMS遷移時間數(shù)據(jù)庫二維定性數(shù)據(jù)庫還不夠完善。綠色框中的揮發(fā)性物質則分別是816和LYL-11中含量較高的揮發(fā)性物質，816樣品中含量較高的物質2-甲基丁酸甲酯、1-戊醇、反-2-庚烯醛、5-甲基-2-呋喃甲醇、丙酸、丁酸、3-甲基丁醇、異戊醇、丙醇和異丙醇等；LYL-11樣品中的含量較高的物質2,6-二甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛和2-甲基吡嗪等揮發(fā)性成分。橙色框中的物質則為幾個樣品都含有且含量相近的揮發(fā)性物質，如苯甲醛、異丁醛、2-苯乙醇、2,3-戊二酮和2,3-丁二酮等。黃色框中的物質，如三甲基吡嗪、異丙醇、戊酸乙酯、戊醛等揮發(fā)性成分，是在LYL-11樣品中含量較低，在其他6 個樣品中含量均較高的組分。

2.4 主成分分析（principal component analysis，PCA）

圖5 不同品種生咖啡豆的PCAFig. 5 PCA of different varieties of coffee green beans

根據(jù)HS-GC-IMS得到不同品種生咖啡豆的指紋圖譜（圖4），能大致區(qū)分生咖啡豆的幾大品種，并確定揮發(fā)性成分差異，但GC-IMS的二維圖形化表達（圖1）會存在一定主觀認知的影響，因此采用PCA方法進一步分析，使不同品種間的特征差異可視化。通過FlavourSpec?食品風味分析儀內置的PCA分類模型，對19 個生咖啡豆樣品的定性及未定性的全部揮發(fā)性化合物分別進行分析（圖5），主成分1和主成分2的方差貢獻率分別為23%和19%。19 個生咖啡豆的樣品GC-IMS譜呈明顯的區(qū)域分布特點，編號799～815阿拉比卡小粒種的不同栽培變種在PCA中相對集中在一定區(qū)域，與編號LYL-11阿拉比卡小粒種和編號816大粒種有明顯間距。這一結果說明采用HS-GC-IMS方法，結合PCA，可有效區(qū)分阿拉比卡小粒種的不同栽培變種、阿拉比卡小粒種及816大粒種。因此，HS-GC-IMS技術可對不同品種生咖啡豆進行區(qū)分，進而篩選分級，該方法具有快速、無損等優(yōu)點。然而，由于樣品數(shù)量有限，下一步可擴大樣品品種、種植區(qū)域及樣本數(shù)量，為建立生咖啡豆快速、無損分類提供科學方法。

3 結 論

揮發(fā)性成分已廣泛用于咖啡豆的地理來源鑒別、質量評價及標準建立等方面[16]，而生咖啡豆具有的揮發(fā)性成分是烘焙咖啡產品香氣形成的重要前體物質之一。本實驗采用FlavourSpec?食品風味分析儀，在無需樣品前處理的條件下，直接加熱咖啡豆原粒樣品頂空進樣，20 min之內快速檢測生咖啡豆中揮發(fā)性化學成分信息。儀器配備的軟件可獲得生咖啡豆樣品的氣相離子遷移二維譜圖、指紋譜圖以及PCA等，快速分析生咖啡豆樣品間的共性與差異，對不同品種的生咖啡豆進行了分類劃分；內置的NIST數(shù)據(jù)庫可定性化合物的組分，共鑒別出42 種揮發(fā)性化學成分。此方法快速、靈敏、準確、無損的特點，為生咖啡豆將來分類識別、產地追溯、品質控制與評價方法提供了一定參考依據(jù)和理論基礎。在咖啡原料品種選育、生豆篩選分級、加工工藝優(yōu)化、感官品控、質量標準建立等方面將具有很好的應用前景及指導意義。

該實驗方案屬于新的分析技術在咖啡豆揮發(fā)性成分檢測中應用的創(chuàng)新性試探[36]，實驗中生咖啡豆樣品數(shù)量較少、來源單一、區(qū)域覆蓋面窄。如果加大樣品數(shù)量，回集不同來源的生咖啡豆，建立各自指紋圖譜的揮發(fā)性成分數(shù)據(jù)庫模型，將為咖啡產業(yè)標準化、品牌化發(fā)展將起到積極的推動作用。