離子色譜法測定生鮮牛奶中硫氰酸鈉前處理方法的研究

黃惠雯

(廣西壯族自治區獸藥監察所, 南寧 530001)

硫氰酸鈉是白色斜方晶系結晶或粉末,在空氣中易潮解,遇酸產生有毒氣體,易溶于水,乙醇,丙酮等溶劑。 生鮮牛奶中摻入硫氰酸鈉可有效抑菌,增加保鮮時長,但硫氰酸鈉是毒害品,少量食入就會對人體造成極大傷害。 硫氰酸鈉的毒性主要由其在體內釋放氰根離子,氰根離子在體內能很快與細胞色素氧化酶中的三價鐵離子結合,抑制該酶活性,使組織不能利用氧而產生中毒。 飲用含有過量硫氰酸鈉的牛奶會對人體造成惡心、嘔吐、腹痛、胃腸道功能紊亂等不利影響,硫氰酸鈉在牛奶中屬于違禁添加物。 目前我國對生鮮牛奶中硫氰酸鈉含量的監測主要采用的是MRT/B 8-2016《生乳中硫氰酸鈉的測定 離子色譜法》,該方法具有靈敏度高,分離效果好的特點,但方法中采用有機試劑乙腈為樣品前處理蛋白質沉淀試劑,乙腈具有毒性大,易揮發,對身體有一定的危害性,嚴重者可致呼吸及循環系統紊亂,陣發性抽搐、昏迷等。 本文以探尋低毒、安全的前處理試劑以及性價比高的固相萃取小柱為目的,對離子色譜法測定生鮮牛奶中的硫氰酸鈉前處理方法進行優化對比。

生鮮牛奶含有豐富的礦物質,種類復雜。 主要成份有水、脂肪、磷脂、蛋白質、乳糖、無機鹽等。 選擇優質的固相萃取柱可對樣品進行選擇性吸附、洗脫、富集、分離、凈化,能很好的去除生鮮牛奶中的雜質,保護色譜柱,并減少對主目標色譜峰的檢測干擾。 因此去除生鮮牛奶中的蛋白質等一些有機物質是保護色譜柱、延長使用壽命的關鍵。 蛋白質的沉淀是從溶液中由液相變成固相析出的過程,常用的蛋白質沉淀方法有鹽析法、等電點沉淀法、有機溶劑沉淀法、生物堿試劑沉淀法等。 本實驗主要考察了有機溶劑沉淀法中的五種蛋白沉淀劑,分別是甲醇、乙醇、乙腈、乙腈+1%乙酸鋅、乙腈+5%乙酸鋅,通過加標回收的方式進行篩選,以便篩選出最憂的沉淀劑。 同時主要考察了C18、MCX、PCX、HLB、RP 5種不同填料的固相萃取柱對生鮮牛奶樣品進行添加適量的硫氰酸根標準溶液后提取凈化,計算回收率,從而選出最佳的固相萃取柱。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ICS900 離子色譜儀(配有淋洗液自動電解發生器,電導檢測器和ASRS 500 型4mm 抑制器,美國戴安公司);電子天平(德國賽多利士公司);高速冷凍離心機(sigma);C18 固相萃取柱(3cc);HLB 固相萃取柱(3cc);MCX 固相萃取柱(3cc);PCX-SPE 固相萃取柱(3mL);RP 小柱(2.5mL);1000μg/mL 硫氰酸根標準溶液(O2Si 公司);甲醇、乙醇、乙腈和乙酸鋅(分析純);去離子水(電阻率為18.25MΩ/cm);0.22μm 有機相濾膜(津騰)。

1.2 色譜條件

45mmol/L 和60mmol/L 氫氧化鉀溶液作為流動相梯度洗脫, IonPac AS-16 型色譜柱(4mm*250mm)和IonPac AG-16 型保護柱(4mm*50mm)分析,柱溫30.0℃,流速1.0mL/min。

1.3 蛋白質沉淀劑的優化方法

稱取4g(精確至0.01)生鮮牛奶樣品置于50mL離心管中,分別用五種蛋白沉淀劑溶液定容至10mL,渦旋1min,靜置沉降蛋白20min,以9500r/min,4℃離心5min。 取出全部上清液,過0.22μm 有機相濾膜,收集濾液供離子色譜儀測定,同時做空白、添加試驗。

1.4 固相萃取柱的優化方法

將C18、MCX、PCX、HLB 和RP 小柱依次用5mL甲醇、10mL 去離子水活化后待用。 利用乙腈沉淀蛋白的生鮮牛奶樣品得到的上清液,過0.22μm 有機相濾膜后,分別注入以上小柱中,棄去前2mL 段濾液,以小于3mL/min 的流速通過。 收集濾液供離子色譜儀測定硫氰酸根濃度,從而計算出生鮮牛奶中硫氰酸鈉含量,同時做空白、添加試驗。

2 結果

2.1 硫酸氫根標準曲線方程

將硫氰酸根標準溶液,準確配制成0.01、0.02、0.10、0.50、1.00 和5.00mg/L 的硫氰酸根標準工作液進行測定。 以峰面積為縱坐標,標準溶液濃度為橫坐標,繪制標準曲線見圖1、圖2。

圖2 表明,硫氰酸根標準溶液在質量濃度0.01～5.00mg/L 范圍內線性良好,該標準曲線的回歸方程為y=0.4840x-0.0124,R2 為0.9995。

圖1 硫氰酸根標準曲線色譜圖

圖2 硫氰酸鈉標準曲線

2.2 不同類型沉淀劑對蛋白沉淀效果的影響

實驗表明,生鮮牛奶樣品加入五種不同的蛋白質沉淀劑,樣品未離心前均出現有不同程度的渾濁凝固狀態,靜置沉降蛋白20min 后,肉眼觀察,乙腈+5%乙酸鋅的沉淀效果相對較好,樣品中蛋白均沉降于底部,上層呈現澄清狀態。 再經過4℃9500r/min高速冷凍離心后,五種沉淀劑均獲得了澄清狀態的樣品液(見表1)。

表1 不同類型沉淀劑對生鮮牛奶沉淀蛋白的效果

2.3 不同類型沉淀劑對硫氰酸鈉回收率的影響

生鮮牛奶樣品經過不同類型蛋白質沉淀劑沉淀蛋白質后,加入適量的硫氰酸鈉標準溶液提取回收計算后得出,乙腈提取效果最好,回收率為98.2%。但是使用乙醇作為蛋白沉淀劑不僅可以有效的去除生鮮牛奶樣品中的蛋白質,獲得96.1%相對較好回收率,而且具有毒性低,試劑相對安全,價格便宜的優勢,乙醇可選擇適用于生鮮牛奶沉淀蛋白質步驟中最佳的蛋白質沉淀劑試(見表2)。

表2 不同類型沉淀劑對硫氰酸鈉回收率的影響

2.4 不同固相萃取小柱凈化對硫氰酸鈉回收率的影響

固相萃取小柱優化比對實驗中,通過樣品實驗加標計算回收率可得出,五種固相萃取柱出峰時間相對固定,周圍不存在雜質峰的干擾,且回收率均大于80%。 其中使用HLB 及C18 固相萃取小柱的樣品均獲得了較好的回收率。 由于未使用前處理小柱過柱的樣品中含量一定的有機物質,出于對色譜柱的保護,不建議采取未過前處理小柱的方式直接上機。 硫氰酸根為帶電荷的強極性陰離子,HLB 固相萃取柱是利用反相吸附洗脫的原理,作用與C18 固相萃取柱相似,但其擁有高吸附容量,與硅膠相比,吸附劑的表面積增大2 ～3 倍。 結果表明,HLB 固相萃取小柱去除有機物質,性價比最佳(見表3,圖3～7)。

表3 不同固相萃取柱凈化對硫氰酸鈉回收率的影響

圖3 HLB 固相萃取小柱色譜圖

圖4 PCX 固相萃取小柱色譜圖

圖5 MCX 固相萃取小柱色譜圖

圖6 C18 固相萃取小柱色譜圖

圖7 RP 固相萃取小柱色譜圖

3 結論與分析

本試驗建立在《MRT/B 8-2016 生乳中硫氰酸根的測定離子色譜法》測定生乳中硫氰酸鈉含量的前提下,對前處理操作中蛋白質沉淀劑及固相萃取小柱進行實驗優化對比,目的是為了得到了更高效、更安全、性價比最佳的操作方法。 實驗樣品分析表明,采用有機溶劑法能快速沉淀生鮮牛奶中的蛋白質,乙醇在對比實驗中凈化效果好、回收率高,且試劑低毒,性價比高的特點。 HLB 固相萃取小柱是酸性,中性和堿性化合物的通用性吸附劑,能凈化,提取和濃縮樣品中的雜質物,回收率高而穩定的特點,即使柱床干涸,回收率也不受影響,HLB 固相萃取小柱在對比實驗中,得到了較高的回收率,對氨基酸、脂肪等雜質有明顯的吸附作用,能減少主目標物硫氰酸鈉的檢測干擾。 經本實驗表明,采用乙醇作為蛋白質沉淀劑及HLB 固相萃取小柱作為生鮮牛奶中測定硫氰酸鈉的前處理方法,操作簡單,性價比高,試劑安全低毒,為生鮮牛奶質量監控提供了可靠依據。