環境樣品中有機錫類環境激素檢測方法研究進展

胡紅美，王 姮，應忠真，孫秀梅，李鐵軍，金衍健，張 博

（浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江舟山 316021）

有機錫化合物（organotin compounds，OTs）常被廣泛用作聚氯乙烯穩定劑、船體防污材料、木材防腐劑、殺蟲劑、殺菌劑，具有高毒性和相對持久性，是環境中備受關注的有機污染物[1]。其中，用于船只防污涂料和殺蟲劑的三丁基錫（TBT）和三苯基錫（TPhT）在水和沉積物中低濃度（甚至不足1 ng·L-1）時就可以對水生生物產生高毒性，導致海洋腹足類生物發生性畸變和破壞內分泌系統[2-4]，目前許多國家已將TBT、TPhT 及其降解產物列于優先污染物的黑名單中，國際公約規定2008 年起所有運營船舶不得含有此類涂料。但有機錫半衰期較長，全球范圍內環境中OTs 的污染仍然十分嚴重。特別是1977-1983 年，在法國阿卡瓊海灣，由于TBT 的干擾造成長牡蠣Crassostrea gigas 貝殼畸形，使當地的經濟損失達8.8 億法郎[5]。自此，世界各國對有機錫化合物（主要是TBT 和TPhT 等）污染進行了研究，內容主要涉及OTs 的分析檢測方法、環境化學行為、性畸變、生態毒理學以及健康風險等領域。在歐盟，目前并沒有就沉積物中的TBT 達成一致的環境質量標準（EQS），然而，《水框架指令》（WFD，2000/60/EC，2008/105/EC）將未經過濾水的EQS 設置為0.2 ng·L-1（平均允許濃度）和1.5 ng·L-1（最大允許濃度）。根據2009/90/EC《化學分析和監測水質技術規范》，檢出限為50 pg·L-1，但很少實驗室能達到[6-7]。

近年來有機錫檢測方法已取得了重大進展，目前常用的檢測方法主要有氣相色譜-火焰光度檢測法（GC-FPD）、氣相色譜-脈沖火焰光度檢測法（GC-PFPD）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）、氣相色譜串聯質譜法（GC-MS/MS）、氣相色譜-電感耦合等離子體質譜法（GC-ICP-MS）、高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS）、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法（HPLC-ICP-MS）、超臨界流體色譜-電感耦合等離子-質譜法（SFCICP-MS）等，且這些方法通常還需要結合液液萃?。↙LE）[8]、固液萃?。⊿LE）[9-11]、索氏提取（SE）[12]、超聲波萃?。║SE）[14-19]、微波輔助萃取（MAE）[20-22]、加速溶劑萃?。ˋSE）[23-25]、固相萃取（SPE）[9-11，13-14，22-23，26-27]、固相微萃?。⊿PME）[16-17，28-31]、液相微萃取（LPME）[16，32-33]、攪拌棒吸附萃?。⊿BSE）[18-19，34-36]、超臨界流體萃取（SFE）[37]等多步前處理。當采用氣相色譜分析時，還需要進行衍生。本文將從樣品前處理方法和環境樣品中OTs 檢測方法兩方面進行詳細的對比分析和系統的論述，為今后環境樣品中OTs 的分析提供技術支持。

1 前處理方法

環境樣品種類較多，基質復雜，當采用氣相色譜聯用技術時，樣品前處理主要包括萃取、衍生和凈化三個步驟；而采用液相色譜聯用技術等其他方法時，只需要萃取和凈化。

1.1 萃取方法

有機錫的萃取方法已經從傳統的LLE、SLE 和SE 方法發生了重大變化，這些方法提取過程耗時、工作強度大，而且使用大量有毒溶劑。USE、MAE、ASE 因具有快速、可批量處理，溶劑消耗少等優點，已成為更普遍的方法[38]。SPE 因其普遍適用性而得到廣泛應用，其預濃縮系數往往高于其他常規技術[39]。SPME 和LPME 因其靈敏度高、有害溶劑用量少，以及可以同時進行原位在線萃取和衍生化而受到人們的廣泛關注[40]。SBSE 與SPME 類似，但富集倍數比SPME 提高了50～250 倍[15]，然而，對于目標分析物，還必須優化萃取和洗脫條件（例如樣品pH、攪拌速度和溫度）。

1.1.1 溶劑萃取

溶劑萃取是用萃取劑提取與之互不相溶的雙組分或多組分溶液，實現組分分離的傳質分離過程。常用的萃取劑有正己烷、乙腈、甲醇、二氯甲烷、鹽酸-甲醇（v/v，1：1）、醋酸-甲醇（v/v，1：1）、正己烷-環庚三烯酚酮等。袁玲玲等[8]在海水中加入鹽酸、NaDDTC 溶液，用200 mL 二氯甲烷分別萃取兩次，再用四乙基硼化鈉（NaBEt4）乙基化衍生，GC-MS 法檢測9 種OTs，回收率為76%～102%，RSDs 為1.24%～13.4% （n=3）。WANG Xiaomeng，et al[9]采用鹽酸-甲醇（v/v，1：1）固液萃取，提取液再用正己烷-環庚三烯酚酮浸提，Grignard 試劑烷基化衍生，弗羅里硅土柱凈化，GC-FPD 法檢測沉積物中丁基錫，回收率為98%～119%，RSDs＜15%，檢出限為0.2～0.7 ng·g-1。CUI Zongyan，et al[11]采用正己烷-環庚三烯酚酮固液萃取、n-PrMgBr 試劑烷基化衍生、硅膠-弗羅里硅土串聯柱凈化，GC-MS/MS 法測定海產品中丁基錫和苯基錫，檢出限為0.5 ng·g-1（干重），回收率為70.5%～133.5%，RSDs 為0.5%～12.5%。

1.1.2 超聲波萃?。║SE）

超聲波萃?。║SE）是由溶劑萃取和超聲波結合形成的萃取技術，主要利用超聲波的空化作用來增大物質分子的運動頻率和速度，從而增加溶劑的穿透力，提高被提取組分的溶出速度，即超聲波的存在提高了溶劑萃取的效率，主要用于沉積物和生物體中OTs 的萃取。LEE，et al[14]以魚類、貝類、海產品為研究對象，環庚三烯酚酮-甲醇-鹽酸為萃取劑，采用USE、Grignard 試劑烷基化衍生，弗羅里硅土柱凈化，GC-MS 法檢測丁基錫和苯基錫，回收率為60%～140%，檢出限為4～8 ng·g-1。PRIETO，et al[19]分別以含Dowex M-41陰離子交換樹脂的鹽酸溶液和10% （m/v） KOH-甲醇溶液為萃取劑，經過USE、HS-SBSE、NaBEt4 乙基化衍生、熱解吸-GC-MS 法檢測一丁基錫（MBT）、二丁基錫（DBT）、TBT，沉積物中檢出限為27～42 pg·g-1，生物體中為14～32 pg·g-1。

1.1.3 微波輔助萃?。╓AE）

微波輔助萃?。╓AE）是利用微波能加熱與樣品相接觸的溶劑，將目標化合物從樣品基體中分離出來并進入溶劑，是傳統溶劑萃取基礎上強化傳熱、傳質的過程，即微波能的存在提高了溶劑萃取的效率，主要用于沉積物和生物體中OTs 的萃取。但微波萃取對溫度要求高，溫度過高時會破壞有機錫樣品的穩定性。HASSAN，et al[20]以海洋沉積物為研究對象，乙酸乙酯-正己烷為萃取劑，在85 ℃下微波輔助萃取30 min，再經過Grignard 試劑烷基化衍生、GC-MS 法檢測6 種OTs，檢出限為18～40 ng·g-1（干重）。FLORES，et al[21]采用WAE、NaBEt4乙基化衍生、GC-MS 法檢測沉積物中MBT、DBT、TBT，分別比較了不同萃取劑，在100 ℃200 W 條件下微波輔助萃取4 min 的萃取效率，結果表明，酒石酸-甲醇為萃取劑時，萃取效率為45%～73%，檢出限為36～116 ng·L-1；醋酸-甲醇為萃取劑時，萃取效率為60%～100%，檢出限為42～52 ng·L-1。

1.1.4 加速溶劑萃取（ASE）

在傳統溶劑萃取基礎上，近幾年發展的ASE，是指在溫度50～200 ℃、壓強10～15 MPa 的條件下，利用有機溶劑對固體或半固體樣品進行萃取的技術。CHIRON，et al[23]等采用ASE 法測定沉積物中丁基錫和苯基錫，使用Dionex ASE 200 萃取儀，甲醇-乙酸-環庚三烯酚酮為萃取劑，萃取溫度100 ℃，5 次循環，萃取液經C18 固相萃取凈化后，進行HPLC-ICP-MS 分析，回收率為72%～102%，RSDs 為8%～15%，檢出限為0.7～2 ng·g-1。NICHOLS，et al[24]采用ASE、HPLC-MS/MS 法測定海洋沉積物中三丁基錫，萃取劑為甲醇-乙酸，萃取溫度為100℃，壓力為1 500 Pa，檢出限為1.25 ng·g-1。ANTIZAR-LADISLAO，et al[25]采用ASE、NaBEt4乙基化衍生、GC-MS 法測定海洋沉積物中丁基錫，萃取劑為甲醇-乙酸，萃取溫度為100℃，壓力為1 500 Pa，回收率為（72.4±5.0）%～（80.5±2.6）%，檢出限為1.00 ng·g-1。采用與傳統溶劑萃取法相比，具有萃取效率高、耗時短、溶劑用量少，自動化程度高等優點。

1.1.5 固相萃?。⊿PE）、固相微萃?。⊿PME）、液相微萃?。↙PME）、攪拌棒吸附萃?。⊿BSE）

SPE 常用于水樣中有機錫的富集萃取。C18 是最常用的吸附劑（無論是萃取柱還是萃取膜）。其他吸附劑如石墨化碳黑、C2、C8 和陽離子交換相等使用較少。在線SPE 結合HPLC 是一個有吸引力的選擇，它可以減少分析時間、勞動力成本和基質效應。據報道使用在線C18 SPE 和HPLC-MS 聯用技術檢測水體中TBT 和TPhT 時，回收率為81%～102%，RSDs 為5.0%～13.1%，檢出限為20 ng·L-1（3.0 mL 水樣）[27]。離線SPE應用也受到了關注。如利用分散分子印跡聚合物（MIPs）原位提取萃取液中的MBT、DBT、TBT、TPhT，再通過HPLC-ICP-MS 檢測，檢出限為0.006～0.02 ng[41]；利用Fe3O4 和分子印跡模板從萃取液中分離出TBT，再通過HPLC-MS/MS 檢測，回收率為78%～96%，檢出限為1.0 ng·g-1[42]。

SPME 主要在SPE 基礎上發展而來。SPME 可以使用直接浸入式（DI-SPME）或頂空模式（HS-SPME），通常使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作為萃取頭。萃取劑的pH、溫度和攪拌條件需要優化，以便有效地將有機錫吸附到SPME 萃取頭上；隨著自動取樣設備的投入，可以自動進行（在線提取、衍生和解吸分析物到GC進樣口）。對于HPLC，需要一個特殊的解吸室來允許流動相進入SPME 萃取頭。但SPME 易受樣品基質干擾，且萃取頭昂貴，但TBT 的檢出限可低至0.025 ng·L-1[43]。LPME 是LLE 的一種改進，因其使用溶劑少，萃取速度快，選擇性高，濃縮倍數高而備受關注。LPME 在有機錫萃取富集方面的工藝主要包括分散液液微萃?。―LLME）[32]、頂空單滴微萃取（HS-SDME）[15]和直接浸入單滴微萃?。―I-SDME）[34]，結合GC-MS，或GCICP-MS，或GC-MS/MS 檢測水體中OTs 時，檢出限范圍為0.4～3.0 ng·L-1。

SBSE 可以直接放置在水樣中，通過持續的選擇性吸附，達到富集待測組分的目的，極大的提高了分析靈敏度。據報道，利用PDMS 攪拌棒和二維氣相色譜-串聯質譜（GC×GC-MS/MS）或LC-MS-MS，海水中丁基錫的檢出限為0.01～0.8 ng·L-1[35-36]。商業上可用的SBSE 吸附劑涂層以前僅限于PDMS，目前還出現C18吸附劑[18]。

1.2 衍生

使用GC 聯用技術檢測時通常需要進行衍生。有機錫的衍生主要包括使用Grignard 試劑或烷基硼酸鹽（通常是NaBEt4）進行烷基化，或使用硼氫化物（如硼氫化鈉NaBH4）進行轉換。NaBEt4由于其在水相基質中的應用，以及具有在線和離線同時衍生和提取的功能，是最常用的試劑[15]。相較而言，Grignard 試劑，因需要專業的處理技術和干燥條件，以避免與水、酸、酮和醇發生反應，不太受歡迎[44]。NaBH4氫化衍生反應劇烈，易產生大量氣泡，帶走氫化的有機錫，重現性較差，而NaBEt4的衍生更簡單，在水相中可將有機錫轉化為它們的乙基衍生物。不過衍生時必須調節pH 值（pH 4～6），使乙基可以親核取代有機錫陽離子。NaBH4可以與水相基質同時進行衍生和提取，但是，由于這些有機錫衍生物的揮發性，可能會發生損失。NaBH4可能受到復雜基質（如生物和沉積物）的干擾，主要來源于與金屬的相互作用以及金屬硼化物的產生（抑制有機錫化合物上Sn H 鍵的形成）[15]。由于上述衍生過程的穩健性，對替代試劑的研究很少受到關注，目前研究者更感興趣的是開發自動化聯機方法，以促進一致性和減少勞動力成本。

1.3 凈化

為減少樣品基質及衍生帶來的雜質干擾，在儀器分析前通常需要凈化處理。主要采用層析柱或商品化固相萃取小柱進行SPE 凈化。常用的凈化柱有弗羅里硅土柱[9，13-14，22]、硅膠-弗羅里硅土串聯柱[11]、C18 柱[22-23]等。小柱中的吸附劑通過極性、疏水等相互作用選擇性地保留物質，再通過淋洗液選擇性地把目標物質洗脫下來，達到對樣品凈化的目的。常用的淋洗液有環己烷[13]、正己烷[9]、正己烷-甲苯（v/v，1：1）[14]、甲醇-水-醋酸（v/v/v，72.5：21.5：6）[23]、丙酮[22]、正己烷[11，22]、含5%乙醚（v/v）的正己烷[22]等。

此外，也有報道采用凝膠滲透色譜（GPC）、硅膠柱SPE 或弗羅里硅土SPE 聯合凈化。沈海濤等[45]建立了一種溶劑萃取、GPC 凈化除脂肪、NaBEt4乙基化衍生、硅膠柱進一步除雜、GC-MS 法測定水產品中三丙基錫（TPrT）、TBT、TPhT，回收率為76%～113%，RSDs 為4.28%～9.14%，檢出限為0.33～0.97 ng·g-1。呂華東等[46]采用振蕩萃取法，以GPC 凈化濃縮液，用戊基溴化鎂衍生，衍生物經弗羅里硅土SPE 進一步凈化后，用GC-PFPD 測定，以內標法定量，建立了魚貝類水產品中8 種OTs 的分析方法，回收率在82%～104%之間，RSDs 為1.4%～13.3%，檢出限為1.00 ng·g-1。

2 檢測方法

2.1 氣相色譜法（GC）

GC 技術是分離OTs 最常用的方法，它具有較高的分辨率和多種靈敏的檢測器可供選擇，如原子吸收光譜法（AAS）、FPD、PFPD、MS、MS/MS、ICP-MS、微波誘導等離子體原子發射檢測器（MIP-AED）等。當采用GC-AAS、GC-FPD、GC-PFPD、GC-MS、GC-MS/MS、GC-ICP-MS、GC-MIP-AED 測定丁基錫和苯基錫的儀器檢出限分別為40～95 pg[47]、0.2～18 pg[47]、0.07～0.48 pg[48]、0.1～10 pg[47]、0.20～0.35 pg[49]、0.012 5～0.17 pg[47，50]、0.01～0.03 pg[47]。常用的氣相色譜柱為非極性柱（如5%苯基甲基聚硅氧烷固定相），一次可分離不同的有機基團（丁基、苯基、丙基）[51]。典型的柱長25～30 m，內徑0.25 mm，固定相膜厚度0.1～0.3 μm。通常采用不分流進樣（1～5 μL，250～280 ℃）。其他的注射技術，如柱上進樣和程序升溫蒸發-大體積進樣（PTV-LVI）可以用來改善靈敏度[52]。PTV-LVI 是一種在線溶劑蒸發技術，在該技術中，較大的進樣量（10～100 μL）在進樣口蒸發。但早期洗脫化合物（如乙基化MBT 和TPrT）的丟失可能會帶來問題，該方法需要仔細優化。用于冷卻入口（＜20 ℃）的低溫裝置可以提高早期洗脫化合物的保留率。樣品運行時間從10～40 min 不等，這取決于分離出的分析物的質量范圍和衍生步驟中生成的有機物類型。

2.2 高效液相色譜法（HPLC）

與GC 法相比，HPLC 法不需要衍生，因此分析速度較快，且可避免交叉污染，但局限性在于靈敏度和檢測器的類型，靈敏度明顯低于GC 法。常用的檢測器有MS、MS/MS、ICP-MS，熒光法目前報道較少。當采用HPLC-MS、HPLC-MS/MS、HPLC-MS/MS 測定丁基錫和苯基錫時，儀器檢出限分別為12～700 pg[53]、10 pg[24]、3.0 pg[50]。HPLC 法需要選擇合適的流動相和固定相，后者包括離子交換、反相、正相、離子對、空間排阻、膠束等[51]。固定相可以通過離子交換或反相色譜法進行廣泛的分類。離子交換固定相通常以苯乙烯二乙烯基苯樹脂或二氧化硅為基礎，陽離子有機錫與流動相反離子在固定相上競爭離子位置[51，54]。苯乙烯二乙烯苯樹脂膨脹會引起壓縮效應，交聯克服了這一問題，但會導致傳質過程的減少。硅基相比更穩定，允許進行更快的洗脫和使用高壓柱。但硅膠柱對pH 敏感，在pH 2～8 時比較穩定，因此，需要使用緩沖溶液來減少峰拖尾[51，54]。在離子交換色譜法中，單取代有機錫的強保留性是個問題，常常需要使用絡合劑和pH 梯度洗脫[51]。如對于硅膠柱，流動相使用甲醇（v/v，50%～90%）和添加鹽（如0.005～0.2 mol·L-1的醋酸銨或檸檬酸鹽）[51，54]。而在反相色譜法中，流動相通常是帶有有機溶劑的水，因而洗脫強度隨時間的增加而增加[51，55]。

3 小結

OTs 的分析檢測方法已經取得了較大的進展，現有的檢測技術基本能滿足大部分環境樣品分析要求。在實際樣品分析時，應根據樣品性質選擇合適的前處理方法和檢測方法。對于OTs 的超痕量分析目前仍具有一定的挑戰，需要專門的實驗室和儀器設備方面的高成本投入。雖然GC 法靈敏度高于HPLC，但前處理仍然相當復雜和耗時，提取和衍生過程是分析誤差的主要來源。在自動化、小型化和減少勞動力方面，在線SPME 和LPME 作為樣品提取和預富集手段取得了較大的進展，但目前仍未被推廣普及。使用硅橡膠被動采樣器進行長期原位監測，并結合高靈敏的分析方法，為實現許多國際指令所要求的低濃度有機錫檢測提供一條前進的道路。