菲律賓蛤仔共附生細(xì)菌Pseudoalteromonas sp.JP 多糖絮凝劑的分離純化及表征

蔣廣寧，崔 霞，穆 軍

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

微生物絮凝劑解決了無機(jī)絮凝劑和高分子絮凝劑在污水處理、食品等方面用量大、二次污染等問題，它還有脫色、吸附重金屬等優(yōu)異性能[1-3]。因此引起人們對絮凝活性物質(zhì)的研究興趣。微生物胞外絮凝物質(zhì)主要為多糖、蛋白質(zhì)、核酸等[4-5]，而胞外多糖被認(rèn)為是絮凝活性的主要物質(zhì)。

海洋微生物物種和代謝產(chǎn)物活性復(fù)雜多樣，有著巨大的研究價(jià)值和潛在用途。因此，海洋微生物的物種分析鑒定、代謝產(chǎn)物活性研究成為人們研究的重點(diǎn)方向。關(guān)于菌株篩選鑒定的報(bào)道很多，但對其活性物質(zhì)的提純、活性測定的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，為了對海洋微生物的物種資源進(jìn)行保護(hù)，合理開發(fā)利用海洋微生物資源，海洋菌株的物種鑒定和分類將發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)，對菌株發(fā)酵液中胞外多糖的提取純化、采用高嶺土實(shí)驗(yàn)測定其絮凝活性，促進(jìn)微生物胞外代謝物在水處理方面的應(yīng)用，這將對微生物絮凝劑的發(fā)展有重要意義。

本文從實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的絮凝活性菌株中選取菌株P(guān)seudoalteromonas sp.JP，對該菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，從其發(fā)酵液中提取分離多糖物質(zhì)，紅外光譜分析了此多糖的主要官能團(tuán)，并對其絮凝活性和脫色活性進(jìn)行測定。目前，這是首次對該菌株胞外多糖純品的提取和紅外光譜分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絮凝活性菌株P(guān)seudoalteromonas sp.JP：實(shí)驗(yàn)室前期篩選鑒定所得。

葡萄糖、尿素、酵母膏、硫酸銨、溴化鉀、瓊脂、蛋白胨、高嶺土、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鈉、濃硫酸、濃鹽酸、苯酚、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：生化培養(yǎng)箱（LRH-系列，上海一恒科技有限公司）；恒溫培養(yǎng)搖床（THZ，上海一恒科技有限公司）；冷凍離心機(jī)（Multifuge 1R，塞默飛世爾科技有限公司）；恒溫定時(shí)攪拌器（JB-3A，上海雷磁儀器儀表有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9023A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（Agilent Cary 60，美國安捷倫公司）。

1.2 培養(yǎng)基

海水培養(yǎng)基：K2HPO4（5 g·L-1）；KH2PO4（2 g·L-1）；CO（NH2）2（0.5 g·L-1）；（NH4）2SO4（0.2 g·L-1）；酵母膏Yeast extract（0.5 g·L-1）；葡萄糖（20 g·L-1）；1 L 人工海水（ASW），培養(yǎng)基初始pH 為7.5。在115 ℃下滅菌30 min。

人工海水配方：NaCl 23.926，Na2SO44.008，KCl 0.677，NaHCO30.196，KBr 0.098，H3BO30.026，NaF 0.003，MgCl2溶液53.27 mL （1.0 mol·L-1），CaCl2溶液10.33 mL （1.0 mol·L-1），SrO2溶液0.9 mL （0.1 mol·L-1）.

1.3 菌株來源

菌株P(guān)seudoalteromonas sp.JP 來源于實(shí)驗(yàn)室的前期篩選鑒定，通過16SrDNA 測序和基因比對，鑒定其為水蛹交替假單胞菌Pseudoalteromonas undina，于2016 年8 月29 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12914。

1.4 絮凝菌株的接種培養(yǎng)及多糖的提取

使用海水培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基裝于4 L 的發(fā)酵罐中，在115 ℃條件下高壓滅菌30 min，等待發(fā)酵罐冷卻至室溫，在無菌室中接種JP 菌株，并在28 ℃、180 r·min-1恒溫培養(yǎng)48 h，滅菌前使用亞硫酸鹽調(diào)節(jié)溶氧量，用pH 電極歸零電位，發(fā)酵開始時(shí)，調(diào)節(jié)溶氧量和pH 為正常培養(yǎng)狀態(tài)。

收集菌株發(fā)酵液并高速離心以除去菌體和殘余代謝物。上清液過濾后濃縮，透析袋（2 000 da）去除小分子物質(zhì)和殘余的營養(yǎng)鹽，在4 ℃下透析24 h，每8 h 換水1 次，濃縮透析液，緩慢加入3 倍體積的無水乙醇，混勻?qū)⒒旌衔镌? ℃冰箱中放置過夜。離心收集混合液下層的白色絮狀沉淀，冷凍干燥后即為多糖粗提物。

將多糖粗品溶液和Sevage 試劑（氯仿：正丁醇v：v=5：1）以相同比例混合，搖勻后靜置30 min，去掉下層和蛋白層，除去蛋白。將得到的去蛋白多糖溶液濃縮，等待下一步的柱層析純化。配制0.5 mg·mL-1的脫蛋白多糖溶液，在紫外可見分光光度計(jì)下進(jìn)行波長掃描，以檢查蛋白是否除去以及是否有存在核酸。

1.5 分離純化

柱層析純化方法采用文獻(xiàn)[7]中的方法并稍作修改。將粗多糖溶液（3 mL）上樣于DEAE 纖維素層析柱（2.5 cm×30 cm），依次用去離子水、0.1、0.3、0.5 mol·L-1的NaCl 溶液洗脫，流速為1.0 mL·min-1，自動(dòng)部分收集器收集洗脫液（5 min/管），同時(shí)用硫酸苯酚法[8]檢測各管的多糖含量，并繪制洗脫液吸光曲線，合并洗脫液后濃縮、透析得到初步純化的絮凝微生物胞外多糖溶液，將多糖樣品溶于5 mL 去離子水中，加樣于Sephadex G-100 凝膠層析柱（1.5 cm×50 cm），用去離子水洗脫，流速為0.2 mL·min-1，自動(dòng)部分收集器分步收集流出液（10 min/管），用硫酸苯酚法[8]測定各管的糖含量，將吸光曲線在同一峰下的各管洗脫液合并、濃縮、冷凍干燥獲得純多糖。

1.6 絮凝活性測定

絮凝活性的測定參照GAO Qi，et al[9]的方法并稍作修改：測定培養(yǎng)液的絮凝活性（絮凝率用FR 表示）。新鮮配制的高嶺土懸浮液（4 g·L-1）用磁力攪拌器高速攪拌1 h。向燒杯中加入93 mL 高嶺土懸濁液，5 mL 1%（m/v） CaCl2溶液，之后加入2 mL 待測上清液。用2.0 mol·L-1氫氧化鈉或2.0 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。快速攪拌絮凝混合液1 min（180 r·min-1）以混合均勻，再緩慢攪拌絮凝體系2 min（60 r·min-1），靜置體系10 min，吸取絮凝混合液上層，用分光光度計(jì)于550 nm 波長下測量其吸光值，用2 mL 的去離子水做空白對照，且每個(gè)樣品平行測定3 次，取平均值。絮凝活性計(jì)算公式為：

其中，A0：對照組在550 nm 處的吸光度；A：多糖樣品在550 nm 處的吸光度。

1.7 脫色活性測定

脫色活性的測定使用文獻(xiàn)[10]中的方法稍微修改，將脫色活性用脫色率（DC）表示。對3 種染料進(jìn)行脫色實(shí)驗(yàn)，包括亞甲基藍(lán)，結(jié)晶紫和孔雀石綠。移取1 mL 的原液（400 mg·mL-1、400 mg·mL-1、1 000 mg·mL-1），稀釋至100 mL，用氫氧化鈉溶液（80 g·L-1）調(diào)節(jié)體系pH 值7.5～8.0，加入樣品溶液（1 mL），將混合物緩慢攪拌1 min 并靜置1 h，以9 000 g 的轉(zhuǎn)速離心10 min，在相同的條件下，分別測量3 種稀釋溶液在660、580和620 nm 處的吸光度，并將去離子水用作參比。脫色活性計(jì)算如下：

其中DC 代表脫色率；A0和A 分別是對照和樣品的吸光度值。劑量范圍為50～300 μg，相應(yīng)的反應(yīng)濃度為0.5～3.0 mg·L-1。

1.8 紅外光譜分析

將純多糖（1 mg）與充分干燥的KBr 粉末（100 mg）混合均勻，將混合粉末在瑪瑙研缽中攆細(xì)成均勻，用紅外線照射烘干，并用壓片機(jī)壓成薄片。然后用紅外光譜掃描儀BIO-RAD FTS3000 在4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)掃描，掃描速率為1 cm-1。去除背景吸收后，可得到多糖樣品的紅外吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 掃描結(jié)果

粗多糖溶液經(jīng)紫外掃描后，如圖1 所示，在220 nm和280 nm 處無特征吸收，表明此多糖溶液蛋白質(zhì)已去除干凈，且不含有核酸。

圖1 去除蛋白后的JP 粗多糖紫外掃描曲線（200～400 nm）Fig.1 UV scanning curve of JP crude polysaccharide after protein removal （200-400 nm）

2.2 柱層析純化

如圖2（A）所示，JP 菌株胞外多糖粗品進(jìn)行陰離子交換柱層析后，在0.1 mg·L-1的NaCl 溶液梯度下，得到1 個(gè)多糖組分，將該多糖組分用凝膠滲透色譜Sephadex G100 進(jìn)行柱層析，如圖2（B），驗(yàn)證了其為單一多糖組分。收集該峰下的洗脫液組分，經(jīng)過濃縮，冷凍干燥后獲得多糖純品。

圖2 JP 菌株胞外粗多糖經(jīng)過陰離子交換柱層析所得的洗脫曲線（A）；離子交換層析組分過凝膠滲透色譜得到的洗脫曲線（B）Fig.2 Elution curve of the extracellular crude polysaccharide of JP strain by anion exchange column chromatography （A）； Elution curve obtained by gel permeation chromatography of ion exchange chromatography component（B）

2.3 活性測定

不同劑量條件下測得JP 多糖純品的絮凝活性，如圖3 所示，在0.8 mg·L-1的JP 多糖劑量時(shí)，最佳絮凝效果達(dá)到83.5%，在反應(yīng)劑量超過1.5 mg·L-1或小于0.2 mg·L-1時(shí)，絮凝效果幾乎為零。同樣，對多糖純品關(guān)于3 種染色劑包括甲基藍(lán)、結(jié)晶紫、孔雀石綠的脫色效果進(jìn)行了探究。結(jié)果顯示，多糖劑量對脫色活性的影響與絮凝活性相似，過多或較低劑量都會影響多糖的活性。多糖反應(yīng)劑量為1.5 mg·L-1時(shí)，對孔雀石綠達(dá)到最佳脫色效果93.6%。絮凝反應(yīng)劑量在0.5～1.0 mg·L-1之間，脫色反應(yīng)劑量在1.5～3.0 mg·L-1之間，對于絮凝或脫色反應(yīng)，對于多糖的劑量有著較高的要求，可見絮凝體系有著嚴(yán)格的反應(yīng)比例。

圖3 JP 多糖劑量對絮凝率的影響如圖3A；JP 多糖劑量對脫色活性的影響如圖3BFig.3 The effect of JP polysaccharide dosage on flocculation rate is shown in Fig.3A； the effect of JP polysaccharide dosage on decolorization activity is shown in Fig.3B

2.4 紅外光譜分析

如圖4 的多糖傅立葉紅外光譜掃描（4 000～400 cm-1）中，在3 406 cm-1處的寬吸收峰為羥基伸縮振動(dòng)吸收峰；2 927 cm-1是脂肪鏈烴C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰；1 647 cm-1處吸收峰是羧基的對稱和反對稱伸縮振動(dòng)的特征峰；1 145 cm-1吸收峰是多糖衍生物中C-O-C 鍵的特征吸收；622 cm-1處吸收峰為C-H 面外振動(dòng)峰。各吸收峰均為多糖的特征吸收，主要官能團(tuán)包括羰基、羥基、亞甲基等典型官能團(tuán)。微生物絮凝劑中羥基和羰基的存在可以改善生物絮凝劑的結(jié)合能力，吸附更多的雜質(zhì)顆粒，促進(jìn)絮凝效果的產(chǎn)生。

圖4 JP 菌株胞外多糖的傅立葉紅外光譜圖Fig.4 The fourier infrared spectrum of extracellular polysaccharide of JP strain

3 結(jié)論

（1）利用離子交換柱deae，采用氯化鈉梯度洗脫的方法和凝膠滲透色譜法去粗取精，獲得JP 菌株胞外多糖純品。

（2）對JP 菌株胞外多糖提取純化，獲得的純多糖組分有著較好的絮凝活性和脫色效率，有望用于其他廢水處理和微生物絮凝劑的開發(fā)。

（3）利用紅外光譜對多糖進(jìn)行官能團(tuán)的鑒定，主要官能團(tuán)有羰基、羥基、亞甲基等，其中羥基、羰基的存在可能對絮凝分子的吸附效果有促進(jìn)作用，絮凝作用與吸附架橋機(jī)理類似。