陰道微生態與不孕癥及其IVF-ET術后妊娠結局的相關性探討

鄧嵐蘭，宋學茹，楊慧鵬，黃建華*

(1.天津醫科大學總醫院空港醫院婦產科，天津 300308；2.天津醫科大學總醫院生殖醫學中心，天津 300052)

據世界衛生組織(WHO)2010年報道[1]，全球不孕癥患病率約為15%。中國女性不孕癥發病率約為7.4%[2]。一項最新的多國家、多中心數據顯示在1990～2010年間，不孕癥患者人數從4 200萬增長到4 800萬，雖然大部分地區的患病率未發生顯著變化，但不孕癥嚴重影響著人們的生活質量[3]。近30年來輔助生殖技術獲得突破性發展，已成為不孕不育治療的核心手段。然而國際范圍內試管嬰兒的累積活產率僅為28%左右[4]，影響其成功的因素涉及到多方面，陰道微生態(vaginal microbiota)的改變目前逐漸引起學者關注。已有研究證實，特定的陰道微生態群落類型不僅影響生殖健康，還可能是不孕癥的病因之一[5]。進一步的研究將關注陰道微生態菌群對生育力的影響，以及陰道微生態是否會對不孕癥IVF-ET治療結果產生影響。本文對陰道微生態與女性不孕癥的關系，以及不孕癥患者陰道微生態的改變對助孕結局的影響進行綜述，以期為臨床不孕癥的治療提供新的思路和參考。

一、陰道微生態對女性生殖能力的影響

(一)健康女性陰道微生態

陰道微生態體系由陰道內微生物菌群、機體內分泌、局部免疫和解剖結構共同組成。女性陰道壁粘膜有多種共生微生物定植，它們在保護陰道抵抗病原感染方面發揮著重要作用，對女性生殖健康產生深遠影響[6]。目前認為正常陰道菌群以乳桿菌為主，隨著高通量測序技術在微生態領域的應用，人們對生殖道菌群分布有了更深層次的理解。育齡期婦女陰道菌群被歸為5類(Community State Types，CSTs)，CST-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ這4種類型都以乳桿菌為主(分別為卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、惰性乳桿菌和姜氏乳桿菌)，而CST-Ⅳ主要包含以厭氧菌為主的其他多種類型細菌[7]。其中，CST Ⅳ-A亞組包含中等量的乳桿菌(以惰性乳桿菌為主)，CST Ⅳ-B則主要包含與細菌性陰道病(Bacterial Vaginosis，BV)高度相關的菌種[8]。陰道微生態的分布因地域、種族不同而有顯著性差異，亞洲和白人健康婦女中陰道微生態菌群以乳桿菌為主的分別占到80.2%和89.7%，而在西班牙和黑人婦女中該比例卻僅為59.6%和69.1%[7]。另一項針對年輕健康黑人婦女陰道菌群的高通量測序顯示，僅37%的健康婦女陰道菌群以乳桿菌為主，約有25%的無癥狀婦女陰道菌群以非乳桿菌為主，但不是疾病狀態，往往此種類型婦女陰道分泌物中存在促炎癥細胞因子和激活的免疫細胞，提示此種類型的陰道微生態可能與感染有一定關系[9]，而且出現不良妊娠結局的風險顯著增高[10]。這就衍生了學者們對于健康的和最優的陰道微生態的探討，即這種無癥狀的以非乳桿菌為主的陰道微生態環境可能是健康的但不是最優的。研究發現惰性乳桿菌對維持正常陰道微生態并無促進作用，還可能增加宿主感染沙眼衣原體的風險，是正常菌群向異常菌群轉變的過度狀態[11]。而絕經前的健康婦女陰道微生態以卷曲乳桿菌為主，因此新的觀點認為以卷曲乳桿菌為主的陰道微生態才是真正健康的標志[12]。在陰道微生態領域還有許多問題值得挖掘。健康女性陰道菌群分布受到激素、月經、性生活等多種因素的影響，并處在一種動態平衡之中，這種平衡對維持女性生殖健康有重要意義。

(二)陰道微生態與不孕癥的相關性

引起不孕癥的病因較為復雜，常包括輸卵管因素、子宮因素、子宮內膜異位癥(EMs)等因素，而近年來生殖道感染已被證實與不孕癥的發生密切相關。將不孕婦女與健康婦女的陰道菌群對比分析后發現，不孕癥組陰道菌群以念珠菌(26.5%)和腸球菌(23.0%)為主，健康組則以乳桿菌(27.8%)和微球菌(15.3%)為主，二者的構成有顯著差異[13]。一篇納入了12項以Nugent評分為評價標準的meta分析(n=3 229)顯示，在不孕女性中BV患病率比對照組高2倍[14]。對先天性不孕癥患者陰道分泌物進行二代測序發現，與健康對照組相比，先天性不孕癥患者陰道菌群譜與BV患者一致[15]。Wee等[16]的研究也證實有不孕癥史的婦女與有生育史的婦女相比陰道菌群分布有差異。可見陰道菌群失調與不孕癥有一定相關性，隨著分子生物學技術的發展，原本被認為是無菌的子宮內膜、輸卵管等上生殖道也發現存在菌群，而陰道微生態失調也被越來越多的研究證實與輸卵管性不孕、子宮內膜因素性不孕存在關聯。

1.陰道微生態與輸卵管性不孕癥的關系：輸卵管因素是引起不孕癥的常見病因之一，正常女性的宮頸發揮屏障作用可有效減少或防止微生物侵入上生殖道，但在某些病理情況下條件致病菌或某些外部侵入的病原菌可上行引起上生殖道感染，嚴重的會導致輸卵管炎癥使得輸卵管完全堵塞或破壞輸卵管內膜導致瘢痕形成，影響輸卵管蠕動，進而引起輸卵管性不孕癥的發生。有研究對300例輸卵管性不孕癥患者盆腔積液和陰道分泌物中的病原菌進行檢測，結果發現輸卵管性不孕癥患者陰道分泌物中優勢菌群發生變化，盆腔積液中病原菌檢出率升高，處于菌群失調狀態[17]。另一項研究顯示在輸卵管性不孕癥患者陰道分泌物中沙眼衣原體檢出率高，解脲支原體陽性率明顯高于對照組，且加德納菌和普雷沃菌的比例較正常受孕女性高，提示解脲支原體和沙眼衣原體感染與女性輸卵管性不孕癥有關，可能是引起女性不孕癥的主要因素之一[18]。而在患有BV的IVF婦女中，因輸卵管因素導致的不孕顯著高于未患BV的婦女(P=0.001)，提示與BV相關的細菌可能上行到上生殖道引起亞臨床感染和盆腔炎癥，引起輸卵管損害并降低生育力[19]，這可能與生殖道上皮組成的免疫屏障對許多細胞因子都較敏感，在BV中容易遭到破壞有關[20]。沙眼衣原體等常見的盆腔炎癥致病菌在患有BV的人群中更普遍[21]。由此可見，雖然在不同取材部位和不同人群中的研究結果有所差異，但輸卵管性不孕癥患者總體呈現陰道微生態失調狀態，且BV以及其他相關致病菌很可能上行感染引起輸卵管性不孕癥的發生，但目前尚缺乏對陰道微生態失調引起輸卵管性不孕癥的直接證據，未來還需更大樣本量和更規范的研究方法來進一步探討二者之間的關系。

2.陰道微生態與子宮內膜因素性不孕癥的關系：女性生育力主要取決于子宮內膜容受性，其受激素、解剖學結構和免疫系統的影響，而微生物群落影響著局部和全身免疫。自1989年Hemsell等[22]首次從健康婦女子宮中分離培養出多種定植細菌以來，越來越多的研究證明宮腔并非無菌，而是呈現以乳桿菌為主的多樣化定植[23]。正常妊娠子宮內膜容受期間，子宮內膜的定植菌群處于高度穩定狀態，而炎癥狀態下子宮內膜容受性明顯降低，腹腔積液中存在活性氧和各種炎癥因子，致使早期胚胎的生存環境相對惡劣[24]。有研究對102例不孕癥患者的宮腔積液進行測序分析發現，不孕癥患者子宮內膜菌群大多以非乳桿菌為主，將這部分患者子宮內膜乳桿菌濃度提升到>90%的水平，可改善IVF后的胚胎著床率[25]。對子宮內膜優勢菌為非乳桿菌的患者使用抗生素聯合益生菌制劑治療，可明顯改善患者妊娠結局[26]，提示恢復以乳桿菌為優勢菌的子宮內膜微環境既可以改善女性生育力和助孕結局。長期以來，上生殖道的感染被認為是由陰道病原菌上行感染所致。將放射性標記的蛋白微球滴注到陰道，最快2 min就能上行進入子宮內[27]，表明液體和微顆粒可以在陰道-子宮間相對自由地移動。Mitchell等[28]對要進行子宮切除的婦女的陰道分泌物和子宮內膜菌群進行qPCR檢測，發現子宮內膜雖存在一些特有的細菌，但其主要菌群與陰道分泌物中主要菌群相同，只是菌量更低。Swidsinski等[29]的研究發現BV患者中有一半人群的子宮內膜中存在陰道加德納菌生物膜。這些研究均表明陰道菌群可上行到上生殖道影響子宮內膜菌群。另外，在對EMs引起的不孕癥患者研究中發現，EMs在陰道炎、宮頸炎患者中發病率更高[30]，EMs不孕女性與未合并EMs的女性比較，陰道、子宮內菌群組成均有統計學差異[23]。可見陰道菌群失調可能增加EMs發生率，甚至造成廣泛的盆腹腔粘連，影響胚胎著床。子宮內膜是胚胎種植和發育的直接場所，因此隨之分子技術的發展未來應該更多關注子宮內膜菌群對女性生育力的影響。

二、陰道微生態與IVF-ET術后妊娠結局的相關性

隨著微生物測序等技術的發展，越來越多的研究表明陰道微生態失調對助孕結局存在影響[31-32]。有學者對31例接受IVF助孕的患者陰道分泌物進行測序分析，發現陰道分泌物群落類型可分為兩類，第一類包含：乳桿菌屬、加德納菌屬、梭菌屬、葡萄球菌屬和小桿菌屬，第二類則包含除第一類外的其他菌屬，而成功妊娠的女性陰道分泌物乳桿菌含量更高，且主要為第一種群落類型中的菌屬[31]。宮頸是連接陰道及宮腔的重要橋梁，一項針對265例IVF-ET助孕女性開展的宮頸菌群培養的研究顯示，大腸桿菌培養陽性率為64%，葡萄球菌屬培養陽性率為8%，培養陽性組IVF移植成功率、臨床妊娠率及持續妊娠率均低于培養陰性組(分別為24% vs. 37%，P=0.02；17% vs. 28%，P=0.04；9% vs. 16%，P=0.01)[32]。對接受IVF治療和未接受IVF治療的不孕癥患者進行研究，發現接受IVF治療的患者子宮內膜菌群乳桿菌含量低于未接受IVF治療的患者，其原因可能與IVF操作過程和接受IVF患者的背景有關，如：頻繁的經陰道檢查、既往人工授精史、頻繁使用抗生素、控制性促排卵(COH)中激素水平波動、取卵和胚胎移植操作以及卵巢刺激的副作用(如卵巢過度刺激綜合征)等[25]。陰道微生態失調可能影響助孕結局，而在IVF-ET治療實施過程中各種因素也會引起陰道微生態的改變從而對助孕結局產生影響。

(一)子宮內膜菌群與胚胎反復著床失敗(RIF)的相關性

隨著促排卵方案的改進和實驗室培養條件的改善，單個周期移植妊娠率增加，但RIF的發生率仍較高。胚胎著床是一個復雜的過程，母體、胚胎及母胎界面免疫反應均可影響該過程導致著床失敗，其中非整倍體胚胎是移植失敗的主要因素，尤其是在大齡女性中。但整倍體胚胎移植失敗率仍達40%左右[33]，提示可能存在其他導致移植失敗的因素。正常子宮內膜菌群處于免疫平衡狀態，參與形成子宮內膜免疫共同體，維持宿主抑制細菌增殖和侵襲的能力[24]。Moreno等[34]的研究發現，子宮內膜菌群以非乳桿菌為優勢菌的婦女其胚胎著床率顯著低于子宮內膜菌群以乳桿菌為優勢菌的婦女(60.7% vs. 23.1%，P=0.02)。而在RIF合并慢性子宮內膜炎患者的子宮內膜中發現NK細胞含量下降，內膜基質中B淋巴細胞募集，子宮內膜局部Th1/Th2免疫失調，可阻礙胚胎著床[35]。有研究對16例子宮內膜炎患者的子宮內膜組織進行分析，發現胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP1)表達上調，同時白細胞介素(IL-11)、趨化因子配體(CCL4)、胰島素生長因子(IGF-1)下調，可以推斷由子宮內膜炎引起的RIF是炎癥表達異常、局部免疫失調、趨化因子介導的綜合過程[36]。子宮內膜局部炎性微環境通過改變黏附因子正常表達，進而引起子宮內膜B淋巴細胞浸潤，滲透至子宮內膜上皮細胞及腺體區，分泌各種免疫蛋白抗體影響子宮內膜容受性，從而影響胚胎著床[37]。

(二)COH對陰道菌群的影響

COH是IVF-ET治療過程中的一個必不可少的環節，在COH過程中體內雌激素水平短時間內快速升高使得陰道菌群分布產生變化。在妊娠期，隨著雌激素水平升高，陰道菌群分布可能發生改變，其中外陰陰道假絲酵母菌病的發病率會偏高[38]。Hyman等[39]研究了30例接受IVF-ET治療的女性在不同階段體內雌激素水平和陰道菌群組成情況，發現所有患者的雌激素水平從初始卵泡至成熟卵泡階段均顯著上升，其中54%伴有陰道菌群改變；從注射人絨毛膜促性腺激素至胚胎移植階段，有5例患者的雌激素水平急劇下降且均伴有陰道菌群改變，提示陰道菌群改變與雌激素水平具有相關性。另一項研究顯示，IVF-ET周期中接受長方案COH的患者，在進行COH后陰道微生態失調者較COH前顯著增加(15.3% vs. 32.0%，P=0.05)；COH前已有陰道微生態異常者更容易發生微生態失調(26.8% vs. 60.9%，P=0.01)，提示接受COH的患者更容易發生陰道微生態失調，且COH前已有陰道微生態失調的患者在接受COH后更易發生失調，影響IVF-ET治療的成功率[40]。因此可在HCG日對COH者行二次陰道微生態檢查，并注意加強宣教及外陰清潔。不同的促排方案對陰道微生態會有不同影響，實施COH后陰道微生態的變化對IVF-ET術后妊娠結局的影響值得進一步研究。

(三)IVF-ET操作對陰道菌群的影響

目前認為宮腔內菌群是由陰道菌群上行定植，而陰道病原菌上行感染可導致炎癥反應。胚胎移植過程中移植管也會將陰道及宮頸處微生物帶入宮腔，進而對助孕結局產生影響。一項對80例接受IVF-ET助孕婦女的研究顯示，若胚胎移植管上培養出細菌會降低臨床妊娠率[41]。宮頸黏液或宮腔內出血導致的移植管污染可降低臨床妊娠率，黏液量越多臨床妊娠率越低[42-43]。越來越多的研究也開始支持在進行胚胎移植時若移植管上定植了卷曲乳桿菌將會提高胚胎種植率和活產率，同時還可降低感染幾率的假設[44]。上述研究均提示，維持以乳桿菌為主的陰道、子宮內膜微生態對輔助生殖技術治療結局有益，因此在進行胚胎移植前應盡量全面評估。

三、結語

女性陰道微生態處在一種動態平衡之中，能影響宿主的生理功能，反之宿主的生理變化也可以影響陰道微生態的組成和功能。陰道微生態失調不僅能引起陰道的慢性炎癥，更與多種因素導致的不孕癥存在關聯。除常見的沙眼衣原體等致病菌外，BV引起的陰道微生態失調也可能導致一些亞臨床改變，成為女性不孕癥的危險因素。以非乳桿菌為主的陰道微生態可能激發宿主免疫反應從而降解宿主粘膜屏障，使機體更易發生感染從而導致不孕或早產等不良妊娠結局[10]，恢復以乳桿菌為主的陰道、宮腔內環境有助于改善助孕結局；同時要注意在IVF-ET治療過程中COH、取卵及移植等操作的影響。陰道微生態與宿主間的相互作用與IVF-ET治療后結局的關系仍存在諸多疑問，隨著分子生物學技術的不斷發展，宮腔、輸卵管等上生殖道微生態對助孕結局影響的研究也已開展。未來還需關注對陰道微生態的作用機制和功能方面的探討，明確其與不良助孕結局之間的相互關系。