蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）家族在生殖領域中的研究進展

許睿真 李洋洋 綜述 丁之德 審校

1. 上海交通大學醫學院2016 級生物醫學科學專業（上海 200025）2. 上海交通大學醫學院組織胚胎學與遺傳發育學系（上海 200025）

半個世紀前，蛋白質二硫鍵異構酶（PDI）是第一個被表征的蛋白質折疊催化劑。它通過顯示其氧化還原酶和氧化還原調節的伴侶活性，在各種生理活動中扮演了重要角色。PDI 是蛋白質二硫鍵異構酶家族成員之一，近年來在神經退行性疾病、代謝性疾病、呼吸道炎癥和癌癥等多種疾病的發病機制中已被證實其重要作用。然而，PDI 蛋白家族在生殖領域雖有報道，但功能及機制尚不明確，本文將對PDI 蛋白家族的結構、功能以及在生殖領域中的作用和進展進行綜述。

一、PDI 家族成員、結構及在內質網中的作用

（一）PDI 家族成員

PDI 家族中所有成員都是硫氧還原蛋白（thioredoxin,TRX） 超家族中的一部分，TRX 超家族還包括谷氨酰還原酶(glutaredoxin,Grx)，硫氧還原蛋白等[1]。迄今為止，PDI 家族共由21 個成員組成，主要成員有PDI（P4HB)、AGR2（PDIA17）、CASQ2（PDIB2）、ERp27（PDIA8）、 PDIA2（PDIp）、ERp57（PDIA3）、TMX1（PDIA11）等,其表達、定位、大小和功能各不相同。

（二）PDI 家族蛋白結構

作為TRX 超家族成員，PDI 家族的共同結構特征是至少擁有一個硫氧還原蛋白樣折疊結構的結構域，即βαβαβαββα。大多數PDI 家族成員都包含催化和非催化的硫氧還原蛋白樣結構域，這兩種結構域分別被稱為a 和b 型域，a'、b'則代表結構域在蛋白質中所處的相對位置[2]。a 和a'結構域在功能上類似于TRX，并且每個都包含催化的CXXC（Cys-x-x-Cys，CXXC）結構域，具有氧化還原酶活性，其中經典的基序則是Cys-Gly-His-Cys。b 和b'結構域沒有催化活性，其作用似乎是活性區域間的間隔區，并通常負責底物的募集。另一方面，PDI家族蛋白并非每種都同時擁有催化基序a 和非催化基序b，如PDI 作為最常見的PDI 家族成員，其結構域組成 為a，b，b' 和a'，擁 有 類 似 結 構 的 成 員 還 有PDIp、ERp57 等，但有些PDI 家族成員僅含催化基序a 而沒有非催化基序b，如ERp18、ADR2 等，而有些成員則僅有非催化基序，如ERp27。PDI 蛋白質家族的另一個共同特征是存在一個由Lys-Asp-Glu-Leu-like 序列組成的COOH 末端ER 保留序列[2]，僅有四種PDI 蛋白家族成員不包含該序列。另外，具有a，b，b'，a'結構域成員其b'和a'域之間有一個較短的域間區域，稱x 鏈接子。

（三）PDI 家族蛋白在內質網中的作用

1.提供形成二硫鍵的環境

PDI 家族蛋白在細胞內主要定位于內質網，也有少量分布于其他亞細胞結構。內質網是參與蛋白質折疊的主要細胞器，PDI 家族在促進蛋白巰基- 二硫鍵轉換、二硫鍵形成及重排中均有著重要的作用，并具有分子伴侶的活性。另一方面，內質網比起細胞質更有利于二硫鍵形成：即擁有更低的還原型谷胱甘肽（GSH）與氧化型谷胱甘肽（GSSG）比例。在細胞質中，谷胱甘肽主要是還原型，而氧化谷胱甘肽的濃度非常低，這種高GSH/GSSG 通過由與NADPH 偶聯的谷胱甘肽還原酶組成的穩健性還原途徑得以維持，而該系統可抑制二硫鍵形成。另外，與NADPH 偶聯的TRX 和TRX 還原酶也可以抑制細胞質內蛋白形成二硫鍵[3]。相反，內質網不含谷胱甘肽還原酶或TRX 還原酶及其同源物，因此GSH:GSSG 的比例較低，即利于二硫鍵形成。

2.在二硫鍵形成中的作用機制

PDI 蛋白家族可催化內質網蛋白二硫鍵的形成。不同PDI 家族成員的TRX 結構域數量和位置及其活性部位的化學性質不同。這些成員通過在二硫鍵形成（氧化反應）中充當電子受體，或在二硫鍵斷裂（還原反應）過程中充當電子供體，催化硫醇- 二硫鍵交換反應。PDI 蛋白還通過催化異構化反應將非天然二硫鍵重排為天然二硫鍵。特定PDI 蛋白充當氧化劑或還原劑的能力取決于CXXC 活性位點的氧化還原電勢。與胞質TRX 的CXPC 基序相比，大多數PDI 蛋白都含有相對不穩定的活性位點二硫鍵, 而ERdj5 是一個例外，它包含四個CXXC 結構域，其中三個包含CXPC 結構域，在其N 端含有一個J 結構域。與胞質TRX 相似，ERdj5 中的活性位點二硫鍵非常穩定，該蛋白是首個在哺乳動物內質網中被檢測出的二硫鍵還原酶。ERdj5 可裂解錯誤折疊蛋白的二硫鍵，以促進其通過內質網膜的逆轉通道。ERdj5 還可將錯誤折疊的底物轉移到Ig 結合蛋白（BiP），BiP 是內質網中主要分子伴侶，它可通過J 結構域中的HPD（Hys-Pro-Asp）基序與ERdj5 結合，并將底物募集到逆轉通道以促進其在內質網的相關降解途徑。

PDI 作為伴侶分子具有將二硫鍵引入底物的作用[4]。該分子伴侶作用依賴于PDI 的氧化還原活性。PDI蛋白的a 和a' 域包含規范的CXXC 活性位點，而CXXC 位點中第一個半胱氨酸的低pKa (酸度系數)使該殘基參與二硫鍵形成[5]。從結構上看，PDI 的四個結構域形成U 構型，催化結構域a 和a'位于頂部彼此相對，而結構域b 和b'則處于U 內部的催化結構域之間。U 內部尤其是b 和b'結構域疏水，并且作為肽和底物錯誤折疊區的主要結合位點。這種疏水區域的存在表明PDI 可充當伴侶分子，抑制錯誤折疊的蛋白聚集[6]。

3.調控Ero1 氧化途徑

如前所述，促使二硫鍵形成的PDI 蛋白將被還原，因此必須重新被氧化以進行下一次的二硫鍵交換，而該氧化途徑則主要依賴于內質網氧化還原酶-1（endoplasmic reticulum oxidase 1,Ero1）。在哺乳動物和其他脊椎動物中存在兩個Ero1 同源物，即存在于所有組織中的Ero1α 和顯示出某些組織特異性表達的Ero1β。人體中，Ero1α 通常在所有組織和器官中表達，而Ero1β 則更多表達于分泌量較大的細胞中（如胰腺β 細胞和產生抗體的淋巴細胞），這種組織分布的差異表明它們可能適用于不同PDI 蛋白，如PDIp 是胰腺β 細胞的特異性PDI，其只能特異性的被Ero1β 所氧化，進而促進胰島素蛋白的折疊和生物活性的形成[7]。

Ero1 也是黃素酶，可利用FAD 作為輔因子將電子從PDI 轉移到分子氧，從而在過程中形成過氧化氫。因此，Ero1 活性過高時會導致高濃度的過氧化氫產生，從而影響細胞活力，如人Ero1α 過表達會引起蛋白應激反應[8]。另一方面，機體可通過PDI 及其同源物的反饋調節以保持Ero1 活性的穩定，并維持內質網中氧化還原的平衡[9]，如Ero1 中的調節性二硫鍵幫助電子在氧化途徑的轉移，PDI 的過度降低會導致Ero1α 的調節性二硫鍵斷裂來抑制其活性。相反，一旦形成足夠的氧化型PDI，將促使調節性二硫鍵的形成以激活Ero1α 活性[10]。

4.PDI 與Prx4 和GPx7/8 協同消除和利用H2O2

Ero1-PDI 途徑產生的H2O2可導致內質網應激的發生，因此，體內需存在能夠及時清除多余H2O2的生理活動。目前，在人細胞內質網中已發現三種過氧化物酶可清除過氧化物，分別為過氧化物還原酶4（peroxiredoxin 4,Prx4） 和 谷胱甘肽過氧化物酶7/8（glutathione peroxidases,GPx7/8）。Prx4 和GPx7/8 可以利用H2O2氧化PDI，并且已有研究顯示多個PDI 家族成員可直接還原Prx4 和GPx7/8 以回收這三種過氧化物酶,保證其在內質網中的含量。另一方面，PDI 自身也被氧化以便進行下一次的二硫鍵交換[11,12]。GPx7 和GPx8 能有效代謝Ero1 生成的H2O2，可能是因為它們在空間上位于PDI-Ero1 復合物附近[12，13]，而Prx4 主要利用獨立于Ero1 來源的H2O2以氧化PDI 家族蛋白[14]。

二、PDI 家族蛋白在生殖領域中的作用

（一）在男性（雄性）生殖中的作用

1993年有研究首次顯示PDI 同工型蛋白在發育精子的頂體中特定定位，并且指出該蛋白可被轉運到成熟精子和附睪精子的核中[15]，揭示PDI 家族蛋白在男性生殖過程中存在潛在作用的可能性。隨后，有研究使用蛋白質組學分析表明，精子中存在PDI 成員如ERp57，ERp72 及PDIA6 等[16]。

1.ERp57

2006年Ellerman 等證實蛋白質二硫鍵異構酶的抑制劑能夠在體外抑制精卵融合，并且ERp57 在配子融合中起關鍵性作用[17]。2007年Ellerman 等又揭示ERp57 位于人睪丸生精細胞的細胞質以及人精子頂體和鞭毛中，該蛋白在精子獲能過程中被修飾，并再次證實其在配子間融合中的重要作用[18]。2010年，Wiwanitkit 根據生物信息學分析發現ERp57 內有三個翻譯后修飾，為明確其缺乏可造成男性不育的分子機制奠定了基礎[19]。2012年，Zhao 等確認ERp57 蛋白存在于大鼠精子發生和形成的各個階段細胞以及Leydig 細胞中，并且ERp57 mRNA 同樣在幾乎所有大鼠精子發生階段的細胞中被轉錄，提示其在精子發生中可能起到的關鍵性作用[20]。2017年，有關ERp57 在男性生殖中的研究又有了新的突破，Wong 等證明ERp57 是多聚精子-透明帶受體復合物（multimeric spermatozoa–zona pellucida receptor complex）的一個組成部分，可通過上調精子表面硫醇含量以調節人類精子和透明帶之間的結合[21]。

2.PDILT

除了普遍存在的PDIA3 外，雄性生殖細胞還表達睪丸特異性PDI 樣蛋白PDILT。該蛋白僅存在于減數分裂后雄性生殖細胞的內質網中，盡管PDILT 沒有共有的CXXC 結構域，且也不是經典的氧化還原酶，但它在體外確實與鈣鎂蛋白（calmegin,CLGN）和模型蛋白相互作用，這表明它可能在精子蛋白成熟中扮演關鍵角色，因此其缺失也是男性不育癥的重要因素之一[22]。2012年，Tokuhiro 等研究表明PDILT 與睪丸特異性凝集素伴侶（包括calreticulin-3 和Calegegin）協同作用，這三種蛋白形成伴侶復合物，有助于精子生成正確折疊的特異性蛋白，并在ADAM3 的二硫鍵形成中起著不可或缺的作用，而ADAM3 是一種精子膜蛋白，其對于精子從子宮遷移到輸卵管以及精子與透明帶結合均至關重要[23]。PDILT 傾向于結合蛋白質底物中暴露的芳香族殘基，其b' 結構域與鈣網蛋白3(calreticulin-3“CRT3”)P 結構域和Calegein（CMG）之間缺乏相互作用位點，這也提示睪丸特異性凝集素分子伴侶與PDILT 之間存在一種獨特的相互作用方式[24]。如前所述，PDILT 是雄性生殖細胞減數分裂后精子發生的特異性蛋白折疊所必需的分子伴侶，但調節該分子伴侶活性的結構機制并不清楚。2018年，Li 等展示了人全長PDILT （hPDILT） 的晶體結構和溶液結構，并分析了hPDILT 的分子伴侶活性，由此提供該蛋白結構基礎以幫助了解PDILT 分子伴侶活性的確切機制[25]。

3.PDIA6 和ERp29

2016年，有研究表明PDIA6 和血管緊張素轉化酶（ACE）是熱休克蛋白A2（HSPA2）的相互作用蛋白，并表明該組裝體位于精子頭部頂體周圍區域的膜筏微區（membrane raft microdomains）中。由于分子伴侶HSPA2在精子獲能過程中精子膜表面重塑起關鍵性作用，并且HSPA2 蛋白表達不足的人精子缺乏識別人卵母細胞的能力。因此，PDIA6/ACE/HSPA2 復合物可能是參與受精級聯反應的關鍵要素。此外，在精子獲能過程中，ACE 表達無明顯變化，而PDIA6 表達卻顯著增加，并且這種表達被證明易受氧化應激的影響[26]。2019年，有研究發現使用等滲和低滲溶液活化鱒魚精子時，精子中PDIA6 的豐度均發生明顯的變化，并且在等滲溶液中，PDIA6 是所有被檢測出的精子蛋白中唯一豐度增加的蛋白，而其它在低滲溶液中豐度變化的蛋白在等滲溶液中卻無明顯的改變,其具體機制目前還尚未明確[27]。

2007年，ERp29 在大鼠精子中的存在首次被報道。隨著精子在附睪內成熟，精子及其表面和附睪上皮細胞質中ERp29 含量均顯著增加[28]。2010年，研究進一步證明了ERp29 在小鼠精子附睪轉運和頂體反應期間的精子上存在顯著性變化。在附睪頭部精子中，ERp29 位于精子頭部的前部區域，而在附睪尾部則存在于精子的整個頭部和尾部區域。此外，ERp29 在頂體反應后仍存在于精子頭部的赤道和頂體后區域，并且證明了ERp29 可能通過促進精卵細胞膜融合而參與精子受精過程[29]。

4.PDIA1

PDIA1 是PDI 蛋白家族在內質網中豐度最高，且介導氧化還原功能的成員，其表達受三碘甲狀腺素（triiodothyronine，T3） 和雌激素的調節。盡管PDIA1 在附睪精子成熟中的作用仍未知，但PDIA1 作為雌激素活性調節劑的潛在功能可解釋其在附睪中的表達作用[30]。2016年，Schorr-Lenz 等證實，在抗促性腺激素釋放激素（GnRH）免疫后，附睪中PDIA1 和PDIA3 的表達均發生了改變，提示附睪中的PDI 表達受內分泌因素影響[31]。2020年，研究發現PDIA1 存在于年輕種馬的附睪液和精子中，其含量比從24月以下幼馬的附睪液中檢測到的含量增加了三倍。成年種馬精液中也能檢測到PDIA1，但其含量與生育力無關[32]。此外，由于雌激素的生物合成不僅發生在睪丸中，也在附睪上皮中繼續進行，因此，PDIA1 在馬附睪液和精子中的存在可能與精子發生和成熟過程的雌激素依賴性有關。

（二）在女性（雌性）生殖中的作用

目前，已有研究報道部分動物的PDI 家族蛋白與女性（雌性）生殖相關，如2013年有研究顯示PDI 在家豬卵母細胞中的分布[33]。在鼠類，2011年Rosewell 等研究證明ERp57 和絲氨酸蛋白酶受到基質金屬蛋白酶2/9（MMP2/9）的調控，而MMP 家族被認為在排卵過程中起重要作用[34]。2014年，Liu 等發現ERp57 在減數分裂I（MI）和減數分裂II（MII）中急劇增加，并可能在精卵融合中扮演了重要的角色[35]。2012年，有研究發現相比于體內成熟的MII 卵母細胞，體外成熟的MII 卵母細胞中PDIA6 表達顯著下調[36]。2019年Li 等人發現在體外使用200ng/ml 生長激素（GH）培養的人卵母細胞中PDIA6 表達比對照組高2.5 倍，因此，PDIA6 在GH組中的高表達表明GH 的添加可為平衡卵母細胞氧化還原穩態提供更好的培養環境[37]。

（三）在胚胎發育中的作用

迄今為止，雖然PDI 在女性（雌性）生殖中作用的研究較少, 但仍發現一些與胚胎相關的研究報道，如2017年有研究首次鑒定出胎盤中存在PDIA4，并顯示IL-11 可調節孕期1-3月的人胎盤絨毛外植體和滋養層細胞中PDIA4 蛋白水平[38]。2014年又有研究指出，植入前因子（preimplantation factor,PIF）通過特異性結合位點與PDI 和熱休克蛋白（HSP）結合，并在防止胚胎內氧化應激和功能性蛋白錯誤折疊過程中起關鍵作用[39]。2017年Goodale 等的研究進一步證明PDI 是PIF 在胚胎中的主要靶標，PIF 可使其成為重要的ROS 清除劑，并且加入PDI 抑制劑16F16 可顯著減緩胚泡發育過程[40]。

三、結語

蛋白質二硫鍵異構酶家族對于細胞內質網中蛋白折疊及二硫鍵形成、還原和異構等是不可或缺的蛋白，并且對其結構、功能以及在不同醫學領域，尤其是在生殖醫學領域中的研究意義重大。目前，對于PDI 家族蛋白在生殖中的研究尚處于初步階段，在女性生殖領域的研究也較為欠缺。因此，在未來逐漸闡明PDI 家族蛋白在整個生殖過程中的作用機制將有助于為臨床上不孕不育癥等相關疾病的診斷與治療提供新的思路以及潛在的靶點。