肝細胞癌的基因組學和基因靶向治療的研究進展

王文晶 曹國洪

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上常見的惡性腫瘤之一。近年來對HCC基因組學的研究已取得一定進展，本文總結了HCC病因相關基因、HCC特異血清指標甲胎蛋白（AFP）相關基因、HCC轉移相關基因等研究成果。另外通過構建HCC特異基因模型，尋找HCC治療的新靶點新方法。本文就此作出如下綜述。

1 HCC發生、發展的基因組學

1.1 HCC病因相關基因研究 目前已知HCC的發生與病毒感染、致癌物污染以及遺傳因素有關。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染在我國HCC病因中占主導地位，其次為強致癌劑黃曲霉素 B1（aflatoxin b1,AFB1），另外一些HCC患者具有家族聚集性和遺傳易感性。總之，HCC的發生涉及多因素多步驟的癌變過程。早前研究發現HBV的DNA可整合入人體HCC細胞的DNA中，經檢測發現HCC組織中HBV-DNA的整合率遠高于正常肝組織，且此現象具有高度易變性和隨機性[1]。通過對81例HBV陽性HCC患者行全基因組測序，研究者發現HBV陽性者癌組織86.4%有HBV-DNA的整合，而癌旁組織僅有30.7%；同時發現在整合位點區域有較多基因拷貝數目變異，其中最主要的3個為端粒酶逆轉錄酶（TERT）、mixed-lineage leukemia（MLL4）gene、細胞周期蛋白 E1 基因（CCNE1）[2]。HBVDNA的整合可引起基因組置換、缺失和反向復制等改變，進而影響細胞周期、分化和凋亡等功能，因此學者發現動態監測HBV-DNA含量變化具有一定意義。如肝動脈栓塞介入治療（TACE）可影響HBV-DNA含量的變化，一些學者對TACE治療前后HBV-DNA含量的變化進行研究，認為TACE治療可引起HBV-DNA的再活化[3]。同樣致病條件，不同人群所致結果不同，因此HCC的發生與個體間基因遺傳多態性有關，即易感基因。經統計HCC發生的性別差異在HBV病例中最為明顯，男性更易發展為HCC。男性HCC發病率為3.7～31.9/10萬例/年，女性為1.4～10.2/10萬例/年[4]。HBV攜帶者中，較高的雄激素通路活性與男性HCC高發病率相關。研究發現雄激素受體通過整合HBV在TERT啟動子區的點突變來增強TERT效應，被認為是HBV相關HCC男性高發病率的機制，因此雄激素受體可能成為HCC治療的靶點[5]。

p53是一種腫瘤抑制基因，正常p53為野生型，可監護細胞基因的完整性；p53突變體不僅喪失抑癌活性，反而具惡性轉化功能。HCC強致癌劑AFB1屬二氫呋喃雜萘的衍生物，研究發現AFB1可使部分p53發生突變生成p53-R249S，即p53第249位密碼子精氨酸（AGG）置換為絲氨酸（AGT）。在含p53突變的HCC中，p53-R249S發生率約為30%，且在HCC高危區的發生率超過96%[6]。另有研究提示HBV編碼的x蛋白(HBx)可能具有促進HCC增殖作用，同時與p53-R249S相互作用促進HCC生長[7]。

肝干細胞（hepatic progenitor cells，HPCs）在正常條件下是靜止的，且數量很少，在肝損傷時可復制分化為肝細胞。研究者在肝腫瘤和腫瘤前病變中觀察到HPCs的活化，認為HPCs也是HCC的干細胞[8]。維生素D作為一種維持機體鈣和磷酸鹽穩態的元素，經肝腎的聯合活化成為維生素D3（VitD3）。研究發現AFB1可通過影響絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）和Hippo信號通路改變HPCs樣上皮細胞系WB-344細胞；VitD3通過激活AKT和關閉Hippo信號通路，來抑制AFB1誘導HPCs的擴增，同時也驗證了VitD3可作為HCC的抗癌劑[9]。含PPPDE肽酶結構域蛋白1（PPPDE1）可編碼人體凋亡前表達蛋白，有研究者發現敲除PPPDE1可以顯著阻斷人HCC的克隆生長和致瘤性，而且PPPDE1是p53蛋白及其下游凋亡通路的關鍵調控因子，對p53有負性調節作用[10]。

HBV感染、強致癌劑AFB1等的相關研究，證實了HCC發生、發展與其密切相關，從而促使人類采取一定措施來預防，如HBV疫苗的普及、避免含AFB1食物的攝入等。

1.2 甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）相關基因研究AFP是胎兒肝細胞產生的一種特殊蛋白——糖蛋白，它是胎兒血清的正常成分，并發現HCC細胞能合成AFP。AFP作為一種特異血清標志物，已廣泛應用于HCC的篩查、臨床診斷及預后復發的判斷。AFP-L3（甲胎蛋白異質體）是AFP糖基化側鏈修飾后的產物之一，在HCC細胞中特異性高表達[11]。研究表明AFP在HCC的細胞增殖和凋亡中發揮重要作用，AFP含量與HCC病灶體積、血管侵襲及分化程度等相關[12-13]。

miRNA是基因表達轉錄后具有調控作用的小分子RNA，研究者發現miR-202是一類具有抑癌基因特性的miRNA，能夠靶向介導原癌基因的增殖侵襲過程并抑制其表達，進而抑制其增殖并誘導其凋亡[14]。研究顯示HCC患者血清中miR-202的表達量與血清中AFP、AFP-L3的含量呈負相關，這就說明miR-202的低表達與HCC的發生密切相關[15]。AFP作為一種常規腫瘤指標廣泛應用于臨床，但經統計實際約30%左右的HCC患者AFP含量為陰性。AFP陰性HCC患者的基因機制如何，還需學者進一步研究。

1.3 肝癌病理分級的相關基因研究 HCC的埃德蒙森-施泰納（Edmondson-Steiner）分級為Ⅰ～Ⅳ級，病理分級一般為高、中、低和未分化HCC，且HCC不同分化程度與預后密切相關。c-myc是myc基因家族的重要成員，c-myc既是一種可易位基因，又是一種可使細胞無限增殖、獲永生化功能促進細胞分裂的基因，c-myc與多種腫瘤發生、發展有關。研究者發現HCC組織中cmyc陽性表達率在低分化HCC中高于高分化HCC，在HCC伴淋巴結轉移者高于不伴淋巴結轉移者[16]。c-myc是不可控型p53的誘導物，可引起p53表達減少，從而導致細胞失控增殖。

1.4 肝癌轉移相關基因研究 整合素αvβ3是整合素家族中的重要成員，作為內皮細胞與細胞外基質的橋梁，通過調節內皮細胞的黏附、遷移、增殖、凋亡等功能，在腫瘤血管生成過程中發揮重要作用。轉化生長因子-β1（TGFβ1）是參與腫瘤增值、侵襲轉移的重要生物因子，在HCC增殖和轉移中轉化腫瘤細胞的生長因子，與HCC的進展有關。

研究者揭示HCC的轉移與骨橋蛋白（OPN）高表達有關，OPN通過與整合素αvβ3或 CD44結合，參與細胞黏附、信號傳導及運動等生物學過程；OPN在伴轉移的HCC組織中呈顯著高表達，通過阻斷OPN的表達可延緩HCC的轉移[17]。經OPN和 TGFβ1基因干擾的高轉移潛能HCC的肺轉移能力有明顯下降，且后者下降更加明顯，研究表明HCC轉移潛能的下降與 OPN和TGFβ1表達減少有關，此研究成果為HCC轉移和預后的基因預測奠定了基礎[18]。亦有研究者發現HCC組織和細胞系中母系表達基因2（MEG2）表達降低，MEG2通過抑制AKT磷酸化從而抑制HCC的生長和轉移，且MEG2表達的下調預示HCC患者的總生存率和無病生存率降低[19]。HCC的生長、轉移和復發都離不開新生血管的形成，載脂蛋白 A-I結合蛋白（apoA-I binding protein,AIBP）可促進清除內皮細胞中的膽固醇，此過程可干擾血管內皮生長因子受體2（VEGFR-2）的功能，進而抑制血管生成[20]。HCC易發生肝內和肝外轉移，如果能掌握HCC轉移機制，就能為HCC治療新靶點、為新型藥物開發奠定基礎，從而控制HCC復發、延長患者無病生存時間。

1.5 肝癌其他相關基因研究 HCC的形成過程極其復雜，包括染色體不穩定性、癌基因表達激活、抑癌基因沉默和DNA修復系統失活等。DNA甲基化是指胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化，是重要的表觀遺傳學改變。通過檢測轉移抑制基因p15、SYK、TIMP-3、E-cadherin、RASSAF1 和腫瘤相關基因p53、RB1、WT1、p14、p16 啟動子區在肝癌、癌旁和正常肝組織的甲基化情況，研究者發現HCC組織有多個基因存在甲基化，且HCC組織甲基化水平較癌旁組織高[21]。

另外影響細胞增殖、侵襲的一些基因也與HCC的發生、發展相關。亮氨酸拉鏈EF-hand結構域跨膜蛋白1（LETM1）和叉頭框蛋白 Q1（FOXQ1）是與 HCC 細胞增殖密切相關的兩類基因。LETM1編碼產物是一類線粒體內膜結合蛋白，其高表達可引起線粒體糖酵解增加、腺苷三磷酸（ATP）生成增多，引起磷脂酰肌醇三激酶（PI3K）/AKT信號通路處于持續激活的狀態，PI3K/AKT是介導細胞增殖的信號通路，與多種細胞的異常增殖相關[22]。FOXQ1是叉頭框轉錄因子家族的一員，涉及胚胎發育、糖類和脂類代謝、細胞周期調控等過程；其突變與腫瘤發生有關。FOXQ1可靶向下游cyclinD1、cmyc的啟動子區域并啟動基因的轉錄過程[23]。

跨膜蛋白3（IFITM3）是與HCC細胞侵襲相關的基因，IFITM3屬于干擾素誘導基因ISG，可以被干擾素和病毒誘導表達。IFITM3編碼產物是一類跨膜蛋白，可通過酪氨酸激酶（JAK）/STAT3信號通路增加基質金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達，通過MMP-9水解膠原蛋白和層粘連蛋白的功能造成胞外基質降解，促進細胞侵襲[24]。

多種基因相關研究為解開HCC的發生、發展打開了大門，通過人類的逐步認識及持續研究，HCC基因靶向治療相關研究也取得較快的發展。

2 HCC基因靶向治療相關研究

實驗常規細胞試劑：正常肝細胞株L02，AFP陽性人肝癌細胞株HepG2和Hep3B，AFP陰性人肝癌細胞株SMMC7721，AFP陰性的人宮頸癌 HeLa細胞。基因載體 pcDNA3.1-AFP-AIBP-yCD/TK、p[HRE]AFP-Luc。

研究者通過構建 AFP啟動子驅動的雙自殺基因（CD，TK）+AIBP基因過表達載體 pcDNA3.1-AFPAIBP-yCD/TK，并分別轉染Hep3B和SMMC7721，轉染后Hep3B細胞生長得到明顯抑制，但SMMC7721細胞生長不受影響；且AIBP表達在HCC細胞中下調，推測AIBP高表達可能抑制HCC新血管生成[25]。由此AIBP有望成為HCC抗血管生成的潛在靶點。

Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族成員，特點是其在正常組織沉默，而僅在各類腫瘤中有所表達，同樣在肝癌組織中 Survivin呈高表達[26]。研究者通過AFP siRNA轉染HepG2細胞，結果顯示AFP表達下調，證明沉默AFP基因進而抑制Survivin表達、促進細胞凋亡[27]。通過構建 pAFP-p53-EGFP重組質粒，并轉染HepG2、SMMC7721和HeLa細胞，研究者發現HepG2細胞p53蛋白表達量明顯高于SMMC7721和HeLa細胞，證明p53的表達具有細胞相對專一性，pAFP-P53-EGFP載體可專一性的作用于 AFP陽性肝癌細胞，引起HCC細胞周期阻滯和凋亡[28]。

研究者構建靶向HCC自殺基因p[HRE]AFP-HSVTK和腫瘤細胞成像基因載體p[HRE]AFP-Luc，并將磁性納米顆粒四氧化三鐵-聚乙烯亞胺（Fe3O4@PEI）作為基因治療載體和磁流體熱療的介質，結果顯示Fe3O4@PEI介導的體內靶向基因治療和磁流體熱療的聯合治療能對腫瘤細胞產生特異高效的協同殺傷作用[29]。Fe3O4@PEI即能在交變磁場中可控升溫，同時又能作為基因載體對腫瘤進行基因治療[30]。

HCC的發生、發展極其復雜，HBV感染、強致癌劑AFB1等病因研究已取得一定成果，AFP相關基因、HCC轉移相關基因等多種基因也進入人們視野，但這僅僅是冰山一角。相信隨著HCC基因組學的開展和深入，將會給HCC研究帶來根本性變化，通過構建與HCC發生、發展、轉移復發和預后相關的指標體系分子分型，為臨床治療方案的選擇提供依據，研究HCC治療新靶點為新型藥物開發奠定基礎，為HCC的臨床治療及預防開拓新前景。