非編碼RNA(noncoding RNA)調控涎腺腺樣囊性癌(SACC)上皮間充質轉換(EMT)機制的研究進展

孫靖淳,韓 冰

(吉林大學口腔醫學院，口腔頜面外科，吉林 長春130012)

唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)又稱涎腺腺樣囊性癌作為常見的頭頸部惡性腫瘤之一，是一種來源于潤管儲備細胞的上皮來源的高度惡性唾液腺腫瘤。典型的臨床及生物學特征為生長緩慢，但局部侵潤性強，高度嗜神經性及肺轉移性，盡管完全的手術切除和輔助放療已被證實可以提高患者的長期生存率，但患者預后仍然較差。近年來，隨著國內外學者對頭頸部腫瘤上皮間充質轉換(EMT)深入研究以及隨著基因組學，表觀遺傳學，分子生物學等生物科學的發展及高通量測序的應用，發現非編碼RNA在調控上皮間充質轉換調控過程中起到了重要的作用，詳細的闡述了涎腺腺樣囊性癌轉移、侵襲的相關機制，尋找對于腺樣囊性癌侵襲和轉移具有特異性的腫瘤標記物可使該并的治療和預后評估產生重要意義，對于臨床治療涎腺腺樣囊性癌開拓了新的思路。本文就幾種非編碼RNA在涎腺腺樣囊性癌(SACC)上皮間充質轉化(EMT)調控機制的研究進展作一綜述。

1 上皮間充質轉換(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)

上皮間充質轉化emt是指在一定的病理或生理條件下，具有極性的上皮樣細胞向具有遷移能力的間充質樣細胞轉化的過程。Emt過程會導致上皮樣表面分子markers表達減少，細胞極性喪失，細胞骨架發生改變重組；而細胞的侵襲和遷移能力大大增強[1]，上皮標志物的丟失如E-鈣黏著蛋白(E-cadherin，E-cad)[2-4]，同時伴有間質樣分子markers表達增多和抗凋亡能力增強[5]。

2 上皮間充質轉換類型及生物標志分子

2.1 依靠不同的生物學類型EMT基本可分為三種類型[6-8]。在哺乳動物生長發育過程中，emt在胚胎發育、原腸胚發育和神經嵴形成中起到了重要的作用，尤其胚胎在顱頜面發育的過程中神經脊細胞遷移形成神經管，以及心瓣膜與肌肉骨的發育[9]。其次，在促進傷口愈合、組織再生和器官纖維化中，emt也扮演了重要的角色[10]。而在癌癥進程和腫瘤轉移的過程中，emt起到主要的調控作用，上皮樣腫瘤細胞受到腫瘤微環境的刺激，細胞骨架發生改變，細胞間黏附分子破壞，分化成具有遷移和運動能力的間質樣腫瘤細胞[11-14]，發生emt轉換后的這些間質樣腫瘤細胞會首先通過分泌基質金屬蛋白酶MMP2和MMP9等突破基底膜進入循環系統，最終在另一組織器官中行成新的轉移灶。在侵襲轉移過程中，發生emt的腫瘤細胞的凋亡也會受到抑制，能夠逃逸免疫系統的殺傷，并且對一些化療藥物的抵抗性增強。相關報道猜測emt能夠誘導產生維持腫瘤干細胞特性[14]。

2.2 經典上皮分子marker如E-cadherin的下調標志著癌細胞發生emt，癌細胞發生轉移[15]。而間質樣細胞marker N-cadherin的上調預示著在胚胎發育炎、癥創傷修復以及腫瘤侵襲轉移最終形成間質樣細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞的轉化。常見的emt上皮分子markers還有ZO-1、β-Catenin、 Occludin 等。EMT 間質分子 marker 也還有 Vimentin、Fibronectin、MMP2、MMP9、和 Twist、Snail、Slug、ZEB1、ZEB2 等轉錄因子[5]。發生emt后的腫瘤細胞，其分泌的MMP2和MMP9因子在癌癥浸潤和轉移過程中發揮著很重要的作用[16]。作為僅有的兩種明膠酶MMP2(明膠酶 A)和 MMP9(明膠酶 B)，其存在于腫瘤細胞胞質內，以非活性酶原的形式(pro-MMP2 和 pro-MMP9)，水解切割抑制性區域后發揮其酶活性[17]。

3 上皮間充質轉換分子調控機制

Emt的發生發展，以及相應的分子調控機制非常的復雜，已報道調控emt的調控因子基本可分為非編碼RNA、生長和轉錄因子、信號通路和表觀修飾酶，這些因子形成復雜的網絡相互作用導致機體內emt的產生。鑒于涎腺腺樣囊性癌嗜神經侵襲這一特殊的臨床、生物學特性，相關研究表明生長因子(如神經生長因子NGF、腦源性生長因子BDNF)在腫瘤細胞中上調，誘導發生emt，而這些神經源性生長因子與涎腺腺樣囊性癌的嗜神經侵襲特性密切相關[18-20]。目前大量研究發現各種轉錄因子如Snail、Twist、ZEB1、ZEB2，通過不同方式抑制上皮分子 E-cadherin的轉錄，增強腫瘤細胞的遷移能力，誘發EMT。這些轉錄因子能夠促進腺樣囊性癌細胞侵襲轉移，對腺樣囊性癌發生發展及轉移起到了重要作用。而各種表觀轉移酶如組蛋白甲基轉移酶、組蛋白去甲基酶等，在表觀遺傳學層面上通過對組蛋白進行修飾影響EMT的發生和進程。

4 非編碼RNA

近年來在現代生物學中，隨著基因組學的深入研究以及高通量測序技術的應用，人們發現遵循中心法則也就是DNA-mRNA-protein過程來編碼蛋白質的基因組僅有約20000個[21]，約占所有基因組序列的1.5%，而一些基因組序列雖進行轉錄過程生成RNA卻不具有編碼蛋白的能力，卻在基因功能調控上起到作用[22,23]。我們稱這些轉錄后不能翻譯蛋白質的RNA統稱為非編碼RNA(non-codingRNA) NcRNA， 包括短小非編碼RNA如miRNA、siRNA與長鏈非編碼RNA(long noncodingRNA) lncRNA,作為基因組中的暗物質，這些非編碼序列，來源復雜[24-26]。具有類型多、作用模式復雜，數量較大等特點，在多層面發揮調控基因表達功能并在參與生命過程中起到重要作用[27]。在不同癌組織中呈現高或低不同表達趨勢與癌癥侵襲轉移密切相關[28-30]。

4.1 非編碼微小miRNA(microRNA)簡介及調控機制

隨著mRNA和miRNA基因組分析、miRNA芯片檢測、qQT-PCR驗證和靶基因軟件預測及miRNA(microRNA)的研究深入，作為一類非編碼長度約18到25個核苷酸小分子單鏈RNA，其功能在調控基因轉錄后表達，機體生長發育、新陳代謝、細胞增殖分化和凋亡發揮著重要作用。miRNA主要通過EMT的關鍵蛋白的mRNA 3’-UTR結合，靶向裂解mRNA或抑制該mRNA的翻譯，從而調控基因表達，最終影響EMT的進程[31]。目前已知miRNA調節多種信號分子及生物學信號通路，其表達與多種人類腫瘤相關。如miR-200 家族成員 (miR-200a、 miR-141、 miR-429、miR-200b、miR-200c)都能抑制轉移相關基因ZEB1 和 ZEB2的表達，而基因 ZEB1和ZEB2則是誘導 EMT發生的關鍵因子，miRNAs 與基因 ZEB1 和 ZEB2之間的負反饋調控也在癌癥轉移中有重要作用[32]。

4.2 長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA)lncRNA )

4.2.1長鏈非編碼RNA簡介 在非編碼RNA中，有一類存在于細胞質或細胞核當中轉錄本長度大于200個核苷酸的轉錄產物,我們把這些缺少開放閱讀框不具備編碼蛋白質能力的轉錄本成為長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA)lncRNA。lncRNA具有三大顯著特征:其一，數量龐大功能多樣;其二，具有顯著的時空和組織特異性，常在細胞核中表達;其三，具有較高的可塑性，能夠對環境變化迅速做出反應。

4.2.2長鏈非編碼RNA調控機制 lncRNA在表觀遺傳調控、轉錄調控、以及翻譯后修飾等多個層面上lncRNA調控基因的表達[31]。在表觀遺傳調控層面，lncRNA通過招募蛋白因子或調節基因表達的表觀遺傳復合物和染色質相互作用，調控染色質狀態，最終來對基因進行表達調控[32]，多種lncRNA如ANRIL、HOTAIR、KCNQ1OT1、HOTAIR、和 XIST均可以和沉默復合物PCR2結合，調控并影響emt進程[33-39]；其中一些lncRNA與染色質沉默復合物結合后，對其進行系鏈重塑，并發揮支架作用，使多種發揮功能復合物通過lncRNA的鏈接形成一大型復合物，對相應基因進行調控，也就是說lncRNA發揮了分子支架作用將不同的分子元件進行組裝以協同發揮調控作用[40]。其次，lncRNA作為轉錄因子誘餌能夠和轉錄因子結合，直接調控基因轉錄表達，影響轉錄過程，而lncRNA則主要通過轉錄水平發揮其重要功能[41]；作為一種信號分子lncRNA可以感知和傳遞細胞內外環境變化對轉錄調控的需求[42]。在轉錄水平，lncRNA可以作為招募因子作為轉錄因子的誘餌或轉錄的共調控子，引導轉錄因子和輔助因子在特定基因簇上的富集或解離[43]。lncRNA還可以直接干擾RNA聚合酶的酶活性或作為增強子RNA(eRNA)來影響或調控基因轉錄[44]。最后，關于轉錄后調控mRNA剪切、轉運和翻譯，及蛋白質亞細胞定位等過程，lncRNA也起到重要作用，其主要通過影響mRNA穩定性、mRNA翻譯以及影響mRNA剪接過程調控基因表達[45]，目前多種lncRNA發現在癌細胞中調控mRNA剪接、編輯和轉運。

4.3 microRNA 與長鏈非編碼 RNAs相互作用

lnc RNAs可以作為分子海綿 (sponges)，以競爭性內源RNA (competing endogenous RNAs，ce RNA)的方式可以與某些miRNA特異性結合，影響miRNA發揮功能。這些lncRNA使得 mi RNAs 不能和其靶基因 3’-UTRs 結合，從而調控 mi RNAs 的靶基因的表達。如在頭頸部腫瘤的食管鱗狀細胞癌中，lncRNA MALAT1(肺腺癌轉移相關轉錄本1，metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)能夠與miR-101和miR-217結合并在轉錄后相互作用，調控腫瘤細胞增殖和遷移。而lncRNA ADAMTS9-AS2能夠與miR-143-3p結合，激活相關通路，發揮促進涎腺腺樣囊性癌侵襲轉移。

5 miRNA在涎腺腺樣囊性癌上皮間充質轉換過程中的相關調控

通過miRNA芯片檢測，靶基因軟件預測等生物信息學的應用，發現大量miRNA(miR-24、miR23b、miR320等)及其靶基因與涎腺腺樣囊性癌侵襲轉移相關[46]，而這些miRNA在SACC癌及癌旁組織中呈現出明顯的差異性表達，抑制或促進SACC發展進程，進而影響SACC侵襲轉移，對其臨床分期及預后產生不同程度的影響。miR-24-3p在肺腺癌中能夠激活FGFR信號通路，參與上皮間充質轉換，誘使癌癥轉移[47]。而相關研究發現miR-24能夠影響SACC下撥的侵襲轉移能力[48]，在SACC中miR-24是否通過emt途徑影響SACC還有待探討。miR-582-5p在SACC癌組織中呈現低表達趨勢與SACC的不良預后及高肺轉移相關，miR-582-5p的下調能夠激活轉錄因子FOXC1，而FOXC1反式激活snail，誘發emt，影響腫瘤細胞增殖促進癌癥的侵襲及轉移[49]。一種在多種腫瘤中高表達并且分布廣泛的非編碼微小RNA，miR-21，能夠促進腫瘤細胞增殖分化，抵御凋亡[50，51]。同樣miR-21在SACC對比癌旁組織在癌組織中表達上調，并能夠誘發emt，促進腫瘤細胞增殖分化增強其侵襲能力，促進SACC的發生發展[52]。辛伐他汀SIM ，一種HMG-CoA還原酶抑制劑，作為一種廣泛應用的降脂類藥物能夠抑制部分腫瘤生長促進凋亡，從而促進化療敏感性，但大劑量的應用能夠導致肌肉酸痛無力等副作用[53]。而SIM聯合miR-21抑制劑能夠通過emt途徑協同抑制sacc細胞的侵襲和遷移[54]。組蛋白甲基轉移酶EZH2，作為一種調控EMT途徑的重要的表觀修飾酶，miR-26a能夠在轉錄后水平及蛋白水平下調EZH2，抑制涎腺腺樣囊性癌細胞的增殖活性[55]。這些miRNA相關機制的研究為臨床上SACC的多靶點治療及減少藥物耐性提供了新的思路。

6 lncRNA在涎腺腺樣囊性癌上皮間充質轉換過程中的作用

lncRNA在腫瘤中不同方面發揮不同作用2011 年 Hanahan and Weinberg 在 cell 綜述上總結了癌癥的六大特征： 能夠無限增增殖、 抵抗細胞死亡、 誘發血管生成、細胞能夠永生化、 侵襲轉移能力增強和逃逸生長抑制[56]。大量現已報道的相關研究表明lncRNA與癌癥的六大基本特征有著密切的聯系，并且各種lncRNA能夠通過emt調控腫瘤進程。在頭頸部腫瘤中大量lncRNA與腫瘤的發生發展相關如MALAT1,HOTAIR,MEG3，H19等。在口腔鱗癌中長鏈非編碼RNA,肺腺癌腺癌轉移相關轉錄本1,MALAT1，相較于癌旁組織其表達在癌組織中顯著增高[57]。相關研究發現MALAT1參與EMT介導腫瘤細胞侵襲遷移或增殖[58]。并且MALAT1能夠通過ATM-CHK2信號通路調控細胞周與凋亡[59]。HOX基因的反義基因間RNA,HOTAIR在多種惡性腫瘤組織中均有增高，在口腔鱗狀細胞癌組織中異常高表達[57-60]。而HOTAIR敲低后通過影響細胞周期促進凋亡，抑制細胞生長[61]。除此之外HOTAIR能夠招募EZH2，抑制E-cadherin表達，促進腫瘤發生EMT，增強腫瘤細胞的侵襲轉移能力。雖然HOTAIR及EZH2在SACC中具體分子調控機制未見報道，但有報道發現EZH2在涎腺腺樣囊性癌中，其癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。我們猜想HOTAIR在涎腺腺樣囊性癌中是否能夠同樣通過EMT途徑，促進腫瘤細胞轉移，影響疾病預后。同樣在乳腺癌中長鏈非編碼RNAANCR能夠結合EZH2，招募CDK1，促進EZH1泛素化降解，通過emt途徑抑制乳腺癌細胞增殖，減弱其轉移侵襲能力，抑制癌癥進程[62]。而lncRNA ANCR是否能在SACC中發揮同樣功能，為我們提供了新的思路。相關研究發現長鏈非編碼RNAH19在口腔鱗狀細胞癌中呈現高表達，而miR138相較于H19其表達有所下調，具體機制研究表明LncRNAH19能夠抑制miR-138表達作為ceRNA，招募EZH2通過EMT途徑促進口腔鱗癌細胞的增殖，增強侵襲轉移能力。同樣H19是否通過EZH2調控SACC有待我們進一步的研究及探索。最新研究發現，通過分子雜交技術(ISH)的應用發現長鏈非編碼RNA ADAMTS9-AS2在涎腺腺樣囊性癌組織及細胞中表達上調，通過qPCR、WB、CHIP、RIP、RNA pulldown、熒光素酶等試驗證實c-myc對其轉錄調，啟動ADAMTS9-AS2表達，并與miR-143-3p結合，競爭性抑制miR-143-3p的表達， 二者相互作用，調控下游靶基因ITGA6 表達，上調下游 PI3K/AKT和MEK/Erk 通路促進 SACC 侵襲和遷移。