銀杏葉提取物對血管性癡呆大鼠記憶力及GAT1、CREB表達的影響

徐 睿，王雪鵬,周 兵

(1.北華大學，吉林 吉林132013；2.北華大學附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 吉林132011；3.吉林大學校醫(yī)院 綜合外科)

血管性癡呆(VD)是由各種腦血管疾病因素引起腦組織受損、腦循環(huán)障礙、而導致的智能損害綜合癥[1]。氧化應激(OS)是由于機體內發(fā)生氧化與抗氧化失衡，從而引起細胞、組織的氧化損傷，其在血管性癡呆的發(fā)生與發(fā)展的每一個環(huán)節(jié)中都發(fā)揮重要作用[2,3]。奧拉西坦(OX)是環(huán)羥基氨基丁酸的衍生物，可有效改善血管性癡呆癥狀，可促進磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇的合成，增加神經(jīng)細胞的蛋白質與核酸的形成作用，但是該藥臨床應用的長期療效不佳[4,5]。銀杏葉提取物(GBE)是一種傳統(tǒng)而廉價的中草藥，化學成分復雜，是從干的銀杏樹葉子內提取的藥用成分，具有調節(jié)血管活性、清除自由基、抗氧化、抗血小板凝聚、調節(jié)血管活性等多種作用[6,7]。γ-氨基丁酸轉運體-1(GAT-1)與cAMP反應原件結合蛋白(CREB)是腦內重要的抑制性神經(jīng)遞質，在阻斷興奮擴散和傳導過程中發(fā)揮重要作用[8,9]。本文為此具體探討了銀杏葉提取物對血管性癡呆大鼠記憶力及GAT1、CREB表達的影響，以明確銀杏葉提取物的作用效果與機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

SPF級成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(30只)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(動物許可證編號00010751，4-5周齡，體重140 g-160 g，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度在22℃-24℃，相對濕度40%-60%，食水自由，12/12 h光照黑暗循環(huán))；奧拉西坦(國藥準字H20183388，青島金峰制藥有限公司)；銀杏葉提取物標準品(中國食品藥品檢定研究院，中國)。酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(寶生物工程有限公司，中國)，抗GAT1抗體與抗CREB抗體(Sigma公司，美國)，氯仿、異丙醇(國藥集團)，無水乙醇(川東化學試劑廠)。

1.2 動物分組與處理

所有大鼠都采用了改良雙側頸總動脈分次結扎的方法制備大鼠血管性癡呆模型，具體措施如下：用濃度為3%的戊巴比妥鈉注射液(體重40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，沿大鼠頸正中線切口切開皮膚，分離雙側頸總動脈與迷走神經(jīng)。采用0號手術線從血管下穿過，將右側頸動脈結扎。縫合頸部手術切口并腹腔注射青霉素注射液10萬，放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。3 d后拆除頸部手術線，進行大鼠左側頸動脈結扎并進行縫合。造模成功標準：跨越平臺時間(逃避潛伏期)顯著延長，跨越平臺次數(shù)顯著少于正常大鼠，精神變差，反應遲鈍。實驗過程中，無大鼠死亡。

把造模成功的大鼠隨機分為三組-對照組、奧拉西坦組與銀杏組，每組各10只大鼠。對照組造模成功后給予生理鹽水10 mg/kg·d靜脈注射，連續(xù)2周。奧拉西坦組在造模成功后給予奧拉西坦10 mg/kg·d尾靜脈注射，連續(xù)2周。銀杏組大鼠造模成功后給予銀杏葉提取物10 mg/kg·d尾靜脈注射，連續(xù)2周。每次給藥過程中，每只大鼠均更換經(jīng)高壓滅菌后導管帽及注射內針，預防感染。

1.3 觀察指標

(1)在造模后1 d、7 d與14 d進行水迷宮實驗，記錄逃避潛伏期。在水迷宮裝置自動記錄大鼠從入水到尋臺成功的時間，即逃避潛伏期，如120 s大鼠仍未找到平臺，則潛伏期為120 s。(2)在造模后14 d處死大鼠，迅速分離雙側的海馬組織，迅即放入液氮中冷凍，于4 ℃下1 000 rpm，離心15 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫法檢測海馬組織IL-1β、IL-6的含量。(3)取海馬組織的樣本，提取總蛋白，采用Western blot法檢測GAT1、CREB蛋白相對表達水平，以β-actin作為內標。(4)取處死大鼠的頸動脈組織，制成病理切片，進行HE染色。然后選擇3個含血管組織豐富的區(qū)域進行計數(shù)，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

選擇SPSS19.00軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)選擇均數(shù)±標準差進行表示，計數(shù)數(shù)據(jù)采用百分比進行表示，本研究多組間數(shù)據(jù)對比用one-way ANOVA分析，兩兩比較用t-test分析與卡方分析等，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 逃避潛伏期對比

三組造模后1 d的逃避潛伏期對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，銀杏組與奧拉西坦組造模后7 d、14 d的逃避潛伏期低于對照組，銀杏組低于奧拉西坦組，對比差異都有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 三組造模后不同時間點的逃避潛伏期對比(s，均數(shù)±標準差)

注：與對照組對比，①P<0.05；與奧拉西坦組對比，②P<0.05.

2.2 病理染色情況對比

對照組：頸動脈血管內膜與鄰近細胞層之間距離增寬，血管內彈力層和中彈力層扭曲，斑塊基底部存在較多泡沫樣改變，內膜下可見增生的平滑肌細胞及堆積的脂質斑塊。銀杏組：頸動脈壁管腔厚度基本一致，血管平滑肌排列基本規(guī)律，血管內膜基本光滑，血管內皮下增生少見。奧拉西坦組：介于對照組與銀杏組之間。

銀杏組與奧拉西坦組造模后14 d的頸動脈微血管密度高于對照組，銀杏組高于奧拉西坦組，對比差異都有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 三組造模后14 d的頸動脈微血管密度對比(血管數(shù)/mm2，均數(shù)±標準差)

注：與對照組對比，①P<0.05；與奧拉西坦組對比，②P<0.05.

2.3 IL-1β、IL-6含量對比

銀杏組與奧拉西坦組造模后14 d海馬組織的IL-1β、IL-6低于對照組，銀杏組低于奧拉西坦組，對比差異都有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 三組造模后14 d的海馬組織IL-1β、IL-6含量對比(pg/ml，均數(shù)±標準差)

注：與對照組對比，①P<0.05；與奧拉西坦組對比，②P<0.05.

2.4 GAT1、CREB蛋白水平對比

銀杏組與奧拉西坦組造模后14 d海馬組織的GAT1、CREB蛋白相對表達水平高于對照組，銀杏組高于奧拉西坦組，對比差異都有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4與圖1。

表4 三組造模后14 d的海馬組織GAT1、CREB蛋白相對表達水平對比

注：與對照組對比，①P<0.05；與奧拉西坦組對比，②P<0.05.

圖1 三組造模后14 d的海馬組織GAT1、CREB蛋白表達水平

3 討論

銀杏葉為銀杏的干燥葉，銀杏為銀杏科的多年落葉喬木，味甘、苦、澀，性平[10]。銀杏葉提取物的主要有效成分包括銀杏黃酮和萜類內酯，具有斂肺平喘、化濁降脂、活血化瘀、通經(jīng)止痛等功效[11]。現(xiàn)代研究表明銀杏內酯是天然血小板活化因子受體拮抗劑，可減輕血小板聚集、微血栓形成和脂質代謝紊亂，穩(wěn)定細胞膜，減少血管緊張素的滲透，改善缺血患者的微循環(huán)，對缺血損傷也有很好的保護作用[12]。還有研究認為銀杏葉提取物有抗脂質過氧化、清除自由基作用，能夠調節(jié)機體血脂含量，使血漿超氧化物歧化酶活性增強[13]。本研究顯示三組造模后1 d的逃避潛伏期對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，銀杏組與奧拉西坦組造模后7 d、14 d的逃避潛伏期低于對照組(P<0.05)，銀杏組低于奧拉西坦組，對比差異都有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；銀杏組與奧拉西坦組造模后14 d的微血管密度高于對照組，銀杏組高于奧拉西坦組，對比差異都有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明銀杏葉提取物的應用能改善血管性癡呆大鼠的記憶力，提高頸動脈微血管密度。相關研究也顯示中藥提取物的應用可以增加大鼠海馬部位K+介導的乙酰膽堿的釋放，增加大鼠的下丘腦神經(jīng)元鈉鉀電流，提升大鼠對空間的認知能力[14]。

炎癥因子的表達貫穿血管性癡呆大鼠發(fā)生發(fā)展的全過程，血清IL-1β、IL-6的表達與癡呆的嚴重性密切相關。本研究顯示銀杏組與奧拉西坦組造模后14 d海馬組織的IL-1β、IL-6低于對照組，銀杏組低于奧拉西坦組，對比差異都有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明銀杏葉提取物的應用能抑制海馬組織炎癥因子的釋放。當前也有研究顯示銀杏葉提取物能降低不穩(wěn)定型心絞痛患者血清炎癥因子單核細胞趨化蛋白-1表達水平[15]；也可使缺血腦組織中TNF-α含量降低，能顯著減少腦缺血再灌注后中性粒細胞在缺血區(qū)腦組織浸潤，減輕腦水腫[16]。

GAT-1屬于高親和力的GABA 轉運體，在腦組織中的含量比較高。正常情況下，GAT1能夠有效的向細胞內轉運GABA，減低突觸間隙GABA含量，從而終止突觸后抑制效應，從而保護神經(jīng)功能[17]。不過也有研究顯示GAT1也可發(fā)揮其逆轉運功能，增強突觸后抑制效應，導致神經(jīng)功能受損[18]。GABA可保持相關神經(jīng)元如感覺神經(jīng)元等活力，修復中樞和周圍神經(jīng)元損傷，增強神經(jīng)元的再生能力。血管性癡呆可引起炎癥系統(tǒng)的激活和氧化應激產(chǎn)生，并對心、腎組織器官產(chǎn)生損傷，從而抑制GAT-1與GABA的表達。本研究顯示銀杏組與奧拉西坦組造模后14 d海馬組織的GAT1、CREB蛋白相對表達水平高于對照組，銀杏組高于奧拉西坦組，對比差異都有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明銀杏葉提取物的應用能提高海馬組織GAT1、CREB蛋白相對表達水平。從機制上分析，銀杏葉提取物為一種天然藥物，成分多樣，有多靶點、多環(huán)節(jié)的防治優(yōu)勢，也具有拮抗血小板活化因子、改善微循環(huán)等多種作用，從而可改善血管性癡呆大鼠的認知損傷和海馬神經(jīng)元損傷[19,20]。本研究也有一定的不足，因銀杏葉提取物是混合物，其藥理機制分析還比較困難，且本研究沒有設置空白對照，可能存在研究偏倚，將在后續(xù)研究中深入分析。

總之，銀杏葉提取物在血管性癡呆大鼠中的應用可促進海馬組織GAT1、CREB表達，提高頸動脈微血管密度，抑制炎癥因子的釋放，從而改善大鼠記憶力。

作者簡介：徐睿(1994-)，男，吉林長春人，碩士研究生，主要從事腦血管疾病的研究；王雪鵬(1978-)，男，吉林吉林人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，碩士研究生導師，主要從事腦血管病、腦腫瘤的診斷與治療。