三種梅毒螺旋體血清學檢驗方法的臨床應用分析

肖 霞，滕春燕，馬 慧，宋丹丹，李艷蕾,王 欣

(吉林大學第二醫院 檢驗科，吉林 長春130041)

梅毒是一種由梅毒螺旋體感染人體產生的慢性傳染性疾病，主要通過粘膜接觸進行傳播，也可母嬰垂直傳播。該病臨床表現較為復雜。病程分為三期，一期、二期又稱為早期梅毒，傳染性強破壞性小，三期梅毒又稱為晚期梅毒，傳染性弱但是破壞性較強，未得到及時治療可造成人體多器官受累，多系統損害，功能失常，如心血管梅毒、骨梅毒和神經梅毒等，甚至危及生命[1]。目前，由于核酸擴增技術尚未廣泛應用于臨床，故血清學檢測仍然是實驗室檢測梅毒螺旋體感染最常用的方法[2]。人體感染梅毒螺旋體后產生兩種抗體[3]，一種針對梅毒螺旋體的特異性抗體，在梅毒感染約2周左右即可產生，此類血清抗體檢測臨床通常使用梅毒螺旋體明膠顆粒凝集實驗(TPPA)，酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、梅毒螺旋體化學發光免疫分析(CLIA)檢測；另一種為針對類脂質類物質的非特異性抗體，通常較特異性抗體出現晚2-3周，臨床可選用快速血漿反應素環形卡片實驗(RPR)、甲苯胺紅不加熱血清實驗(TRUST)等方法進行檢測[4]。本研究采用梅毒螺旋體抗體酶聯免疫吸附實驗(TP-ELISA)、梅毒螺旋體明膠顆粒凝集實驗(TPPA)、快速血漿反應素環形卡片實驗(RPR)分別檢測梅毒患者血清，評價不同血清學檢驗方法的檢測效能，具體操作如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料搜集2019年1月-2019年3月我院門診及住院的10273例患者標本進行梅毒抗體酶聯免疫吸附試驗(TP-ELISA)，患者就診于不同科室，所患基礎疾病不同，其中男性5169名，女性5104名，年齡分布0-97歲，陽性結果再分別進行TPPA,RPR檢測，統計結果。將其中經臨床診斷為梅毒的238例患者作為研究組，臨床診斷及分期標準參照衛生部《中華人民共和國衛生行業標準梅毒診斷標準WS273-2018》。其中男143例，女95例，年齡19-82歲，梅毒一期106例，二期59例，三期16例； 潛伏期57例。選取健康體檢者150例作為對照組，其中男83例，女67例，年齡17-85歲。所有檢測標本均為空腹采集的靜脈血血清。

1.2 方法

1.2.1儀器和試劑 主要試劑選用珠海麗珠試劑股份有限公司ELISA試劑盒、日本富士瑞必歐株式會社梅毒螺旋體診斷試劑盒(明膠顆粒凝集法)、上海科華生物技術有限公司RPR試劑盒；儀器選用愛得康ELISA600全自動酶免分析儀。

1.2.2檢驗方法 于清晨空腹狀態下采靜脈血3 ml，離心分離血清(4 000 r/min，6 min)。嚴格按照相應說明書中的方法進行操作，首先進行TP-ELISA檢測，檢測結果S/CO≥1的標本，再分別進行TPPA、RPR檢測，具體方法如下：(1)ELISA法： 應用艾德康全自動酶免分析儀進行操作，操作過程嚴格按照試劑盒說明書設定程序，反應完成后通過酶標儀檢測吸光度，吸光度OD>0.105即(S/CO值>1)判定為陽性。(2)TPPA法：將100 μl血清稀釋液加至微孔板第1孔內，其后3孔各加入25 μl。用微量移液器取樣品25 μl至第1孔中，混勻后吸出25 μl至第2孔，同樣方式稀釋至第4孔，在第4孔混勻后棄去25 μl。稀釋后第3孔、第4孔稀釋倍數分別為1∶20、1∶40，使用微量加樣器在第3孔中加入25 μl未致敏顆粒，第4孔中加入25 μl致敏顆粒，此時樣本最終稀釋倍數為1∶40、1∶80，混勻后室溫水平放置2 h后觀察結果。陽性判定標準：第4孔反應產生環狀分散粒子判定為陽性。(3)RPR法：血清進行倍比稀釋至1∶2、1∶4、1∶8、1∶16實驗卡標號1-4；依次從圈4-1將稀釋后標本涂布于整個圈內；加入1滴抗原(約17 μl/滴)；將實驗卡置于水平旋轉儀，100±2 r/min旋轉8分鐘；取出實驗卡在亮光下肉眼觀察結果。若標本出現黑色塊狀沉淀，即判定為陽性，陽性結果應報告其稀釋倍數，即為其滴度。三種方法檢測完畢，結合臨床表現，選取有明確診斷的標本作為研究組，與對照組進行比較，針對三種檢測方法的敏感性和特異性進行比較。

1.3 統計學方法采用SPSS19.0統計學軟件對本研究數據進行分析處理，計數資料采用(n，%)表示，數據比較行χ2檢驗，設置檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 10273例患者標本進行梅毒抗體酶聯免疫吸附試驗(TP-ELISA)的一般情況10273例患者為我院門診及住院患者，就診于不同科室，所患基礎疾病不同，男性5169名，女性5104名，其中TP-ELISA檢測陽性的患者共336例，男性171例，女性165例，陽性率約3%，年齡分布見表1。

表1 TP-ELISA陽性患者年齡分布

2.2 336例TP-ELISA陽性，3例TP-ELISA弱陽性共計339例患者的TPPA結果與TP-ELISA結果符合率隨TP-ELISA S/CO值的升高呈現同步升高趨勢,見表2。

表2 TP-ELISA TPPA檢測結果的符合率

2.3 三種檢測方法敏感度、特異度分別統計238例梅毒患者與150例非梅毒患者的三種檢測方法結果得知，TPPA法敏感度與特異度分別為97.47%、99.33%；ELISA法分別為98.32%、98.00%；RPR法分別為78.57%、94.00%。見表3。

2.4 三種檢測方法在不同分期梅毒患者的陽性檢出率對于一期、二期與潛伏期梅毒，RPR方法檢測的陽性率明顯低于TPPA、ELISA法(P<0.05)，而對于三期梅毒，三種方法檢測的陽性率未有明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 三種梅毒螺旋體檢測方法敏感度和特異度

表4 不同分期梅毒患者的陽性檢出率

3 討論

梅毒在我國傳染病防治法中被列為乙類防治病種，近年來在我國患病率持續攀升，該病早期主要侵犯皮膚和粘膜，晚期還可侵犯心臟血管系統及中樞神經系統，造成重要器官及組織永久性損害[5]。梅毒病程較長，早期防治控制病程進展是治療關鍵，目前臨床上依據患者病史、血清學檢測結果、臨床表現進行綜合診斷，故提高實驗室血清學檢測梅毒螺旋體的靈敏度，選擇合適的檢測方法，對于明確診斷、盡早治療梅毒具有重要意義。梅毒螺旋體感染人體，可產生梅毒螺旋體非特異性(抗類脂質抗體)與特異性兩種不同的抗體類型，兩種抗體的檢測對于梅毒患者的篩檢及確認具有不同的臨床意義，非特異性抗體又稱為反應素，在梅毒螺旋體感染3-4周產生，伴隨著有效治療而消失，后者為特異性抗體，在感染2周左右產生，這種IgG類型抗體一旦產生，便會終身攜帶，不會隨著有效治療而消失。兩種抗體在疾病的診斷，療效觀察，復發判斷方面具有不同的意義。本研究中所選TPPA、ELISA檢測方法針對特異性抗體、RPR檢測方法則針對非特異性抗體進行檢測， 探討了三種檢測方法的符合率及臨床應用價值。

本次研究對象為我院門診及住院患者共10273例，因為ELISA方法操作簡單，可作為高通量的檢測項目進行自動化儀器操作，且敏感性較好，所以被作為首選的篩查方法。檢測結果經過判讀后，共336例判斷陽性，陽性率約3%，其中由于參與檢測的患者年齡不同，所患基礎疾病不同，存在一定引起TP-ELISA法生物學假陽性的因素。TPPA法檢測是采用梅毒螺旋體毒株作為抗原包被在凝膠顆粒上，與梅毒血清樣本中的特異性抗體結合產生顆粒凝集。是目前較權威的梅毒確診實驗[6]方法，所以，我們將ELISA 檢測判斷陽性的336份及處于檢測灰區(S/OD值0.9-1)的3份標本共339份又進行了TPPA法檢測，統計ELISA與TPPA檢測陽性符合率，發現兩者符合率隨TP-ELISA檢測S/OD值升高而升高，在TP-ELISA法測定值為 1-6 區間時，兩者符合率為僅為43.8%(39/89)。 因此對臨床用ELISA 法檢測到(S/CO)低值樣本時，用 TPPA 法開展確證實驗尤為必要，并應結合臨床表現加以判斷，以減少因ELISA法假陽性發生而引起的誤診。

336例TP-ELISA陽性的患者中，經臨床確診的梅毒患者為228例，我們又選取了150例非梅毒患者進行TP-ELISA法,TPPA法,RPR法三種方法同時檢測，并對比三種方法的應用價值。檢測結果顯示：在敏感性方面，檢測梅毒特異性抗體的TPPA法在一期梅毒及二期梅毒的檢測敏感性略低于TP-ELISA 法檢測，但不具統計學意義；RPR法敏感性最低。RPR法檢測的為梅毒非特異性抗體，即類脂質類抗體，其出現較特異性抗體晚，因此其在一期梅毒的敏感性要低于TPPA和TP-ELISA法，類脂質類抗體會隨著梅毒有效治療而逐漸消失，這也是引起RPR 檢測的檢出率在各期梅毒均低于TPPA及TP-ELISA的原因之一；在特異性方面，TPPA法在三種檢測方法中特異性最高，RPR法特異性最低。盡管如此，TPPA法和TP-ELISA法仍存在約1%的假陽性率，如老年患者、腫瘤患者、自身免疫性疾病患者、孕婦、長期吸毒患者，及部分合并其他螺旋體感染的患者均會引起特異性抗體檢測的生物學假陽性反應，而且梅毒特異性抗體的陽性結果無法區分患者處于是發病期還是繼往感染，因此不能夠單純依據檢測結果進行診斷[7]梅毒，需結合臨床癥狀進行判斷，RPR法檢測的抗體不具有特異性，許多疾病如結核病、麻風等在疾病過程中均產生類似抗體，故RPR法假陽性率較高。臨床上，該法常用于通過觀察滴度的變化來判斷梅毒療效或觀察病程[11]。

梅毒血清學檢驗在臨床診斷中占據重要地位，TPPA、ELISA敏感度與特異度均較好，在各期梅毒診斷中均具有良好的穩定性，是較為理想的血清學檢測方法。RPR法靈敏度和特異度雖略低于前兩者，但作為梅毒療效評價方法成本低，操作簡單，被廣泛應用。TPPA或ELISA法聯合RPR可作為梅毒篩查的可靠方法[12，13]，在提高陽性檢出率同時減少假陰性率，并作為觀察梅毒療效及病程的重要指標，指導患者得到及時有效的診治。對于梅毒檢出陽性患者，臨床醫師還應結合病史、癥狀、體征等綜合分析，以提高確診率[14]。