血清及支氣管肺泡灌洗液GM試驗在侵襲性肺曲霉病早期診斷中的價值分析

辛 娜,吳躍剛

(1.西安醫學院第一附屬醫院 檢驗科，陜西 西安710077；2.西安市華山中心醫院 呼吸內科，陜西 西安710043)

侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis，IPA)是由曲霉引起的支氣管肺部真菌感染，免疫功能低下者是其主要高發人群。隨著社會老齡化、危重患者廣譜抗生素的長期應用， IPA的發病率也在不斷上升[1]。IPA臨床癥狀往往缺乏特異性，易被基礎疾病所掩蓋，病死率較高。半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)試驗是早期診斷曲霉菌感染的一種常用血清學方法，然而目前GM 試驗試劑盒應用說明大多局限于血清樣本，鑒于支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 和血清標本來源和性質的不同，其GM 試驗閾值的設定仍存在諸多爭議。本研究通過比較IPA 患者的血清及BALF的GM抗原，評估GM試驗在不同閾值下的診斷效能，探討血清及BALF標本GM試驗在IPA早期診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取 2018 年 1 月至2018年8 月經確診及臨床診斷的IPA患者25例作為病例組，符合《侵襲性肺部真菌感染的診斷標準與治療原則(草案)》診斷標準，選取同期就診的非肺曲霉病的患者作為對照組(n=75)。患者一般情況差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

1.2 儀器與試劑GM 試劑盒：美國BIO-RAD曲霉菌抗原檢測試劑盒(酶聯免疫法)(伯樂生命醫學產品上海有限公司，貨號：7J0051)；Thermo MULTISKAN FC型全自動酶標儀讀取吸光度(OD值)。

1.3 標本采集

1.3.1BALF收集 按常規支氣管鏡操作規程進行BALF采集，注入20 ml 37℃滅菌生理鹽水對病變部位進行支氣管肺泡灌洗，回收5-10 ml BALF裝入一次性無菌硅塑瓶中及時送檢。將待測BALF用一次性無菌吸管轉移至10 ml離心管，10 000 r/min 離心 10 min后吸取上清液600-800 μl，-40℃保存待測。

1.3.2血清標本 行支氣管鏡檢查當日采集靜脈血3 ml，3 500 r/min 離心10 min，4℃冰箱保存待測。

1.4 GM試驗采用一步法酶免夾心微孔板方法，檢測血清和BALF標本中的半乳甘露聚糖。按照試劑盒說明書中的操作步驟進行操作。每次實驗均設陰性對照、陽性對照、臨界值對照以驗證實驗結果的有效性。結果計算：GM指數(I值)=待測樣本OD值/臨界值對照OD值均值，根據GM指數進行GM試驗陽性閾值的界定。

表1 兩組患者一般情況比較

2 結果

2.1 兩組血清及BALF標本GM試驗I值比較兩組血清及BALF標本GM試驗I值差異均有統計學意義(t=3.73、5.46，P均<0.05)；對照組和病例組血清與BALF GM試驗I值差異均有統計學意義(t=5.03、7.46，P均<0.05)。見表2。

表2 兩組血清及BLAF標本GM試驗I值比較

注：★與病例組比較P<0.05；#血清與BALF標本比較P<0.05

2.2 ROC 曲線分析運用ROC曲線下面積評估兩種不同標本類型GM試驗對IPA的診斷效率，結果顯示BALF GM的曲線下面積(0.837)高于血清GM(0.761)。表明BALF GM試驗的診斷價值一定程度上高于血清GM，見表3。

表3 曲線下面積

2.3 血清及BALF標本GM 試驗診斷 IPA 結果的評估分別以0.5、0.8、1.0、1.2、2.0作為診斷閾值，計算各診斷閾值下GM 試驗診斷IPA 的敏感性、特異性、約登指數。以約登指數最高為原則，確定診斷閾值，本研究得到血清GM實驗，以≥0.5為診斷閾值；BALF GM試驗以≥0.8為診斷閾值,見表4、圖1。

表4 血清及BLAF GM試驗不同閾值下診斷效率評估

圖1 血清GM和BLAF GM標本診斷IPA的ROC曲線

3 討論

侵襲性肺曲霉病是重要的機會性深部真菌感染，對人體健康危害極大[2]。半乳甘露聚糖(GM)是曲霉菌細胞壁的組成成分，檢測患者血清中GM 抗原水平是曲霉菌感染早期診斷的敏感指標[3,4]，因此臨床醫生應高度重視曲霉菌感染的早期診斷，以助于及時采取有效的治療措施。

GM試驗常用的標本類型是血清和BLAF。在曲霉菌局部感染時，由于菌絲少，釋放的GM抗原量少，以及釋放入血后很快被清除等原因，導致血清GM試驗容易產生假陰性結果。同時，由于真菌感染早期并未進入血液，故血清中峰濃度出現較遲，不利于IPA 的早期診斷。而支氣管肺泡灌洗時無菌生理鹽水能夠直接到達肺部感染病灶，在BALF中存在大量的吞噬細胞，能將真菌吞噬后釋放較多的半乳甘露聚糖，從而提高早期診斷的敏感性[5]。目前，血清標本的GM試驗大多以0.5作為診斷閾值。由于BLAF和血清標本來源和性質的不同，BLAF進行GM試驗時其診斷閾值的選擇[6]，或敏感性、特異性的評價還存在較大差異[7]。ZOU 等[8]一項Meta 分析指出，當cut-off值為0.50時，BALF-GM的敏感度達0.87，特異度 0.89，診斷效率較血清 GM 具有優勢。而有文獻研究則考慮當 cut-off 值為 0.80 時，BALF-GM診斷效益最高[9]。國內也有學者認為將BALF-GM試驗的I值設定為≥2.1為陽性結果，對 IPA 更具診斷價值[10]。不同研究對于BALF-GM試驗最佳界值和敏感度等評價存在區別，可能與具體操作及收集方法的差異、實驗人群選擇的不同相關。有研究顯示[11]采用小劑量灌洗對重癥呼吸衰竭患者安全性較高，避免在灌洗過程中將霉菌及定值菌等播散到遠處，引起感染或炎癥加重的風險。因此本研究所有BALF的采集均采用小劑量灌洗，排除因灌洗量不同造成試驗結果的差異。

本研究中，病例組和對照組血清及BALF標本GM試驗I值差異有統計學意義，并且同組內血清標本與BALF標本GM試驗的I值也存在顯著性差異,這也提示，血清標本和BALF標本GM檢測使用同一診斷閾值可能存在一定的不足。比較不同閾值下血清及BLAF GM試驗診斷IPA的效能，結果顯示當血清GM界值≥0.5時，敏感性40%，特異性96%，約登指數最大為0.36。而BALF GM界值≥0.5時，敏感性92%，特異性54.7%；界值≥0.8時，敏感性92%，特異性提高到65.3%，約登指數最大為0.57；界值≥1.0時，敏感性顯著下降，只有76%。約登指數是綜合評價篩查試驗準確性的方法，指數越大說明篩查試驗的準確性越高、效果越好。因此，本研究認為血清 GM界值設定為0.5較合適，而BALF GM界值設定為0.8較合適，具有較高的敏感性和相對較好的特異性。

目前文獻報道血清GM試驗診斷IPA的敏感度、特異度分別為60%-100%、80%-100%[12],而在肺泡灌洗液中，如果以吸光度>0.5作為IPA的診斷標準，其敏感度、特異度可達 80%-93%、89%-98%[13,14]。本研究中血清GM試驗和文獻比較敏感性偏低，只有40%，分析原因可能是因為本研究病例組樣本量較少，多為年老體弱的ICU患者，合并嚴重基礎疾病，造成試驗結果存在一定程度上的偏倚。然而也有文獻表明GM試驗在不同研究對象中的結果存在一定差異[15]，推測 GM 試驗可能需要根據不同的基礎疾病或免疫力等而設定不同的最佳界限值，這方面可能需要更多的研究去證實。本研究中BLAF GM試驗和文獻比較特異性偏低，只有65.3%，分析原因可能是對照組中部分患者臨床診斷為吸入性肺炎，普遍存在誤吸病史，可能食物中的GM抗原進入呼吸道導致假陽性，也有可能是BALF樣本與外界空氣環境為開放性，使一些青霉菌、曲霉菌污染樣本，導致GM實驗呈現假陽性。

綜上所述，血清標本和BALF標本GM試驗在IPA的早期診斷中都有重要的價值，BALF 標本 GM 試驗的診斷效能一定程度上高于血清標本。由于血清及BALF GM試驗的敏感性和特異性有所差別，臨床應用中建議多次送檢同時結合不同標本類型進行綜合判斷，從而更好的發揮GM試驗在IPA早期診斷中的價值。