長鏈非編碼RNA-ATB在結直腸癌組織中表達及臨床意義

劉 郁，耿加敏，段紹斌

(新疆醫科大學附屬中醫醫院，新疆 烏魯木齊830000)

隨著我國人民群眾飲食結構的改變，結直腸癌發病率呈不斷升高趨勢[1]，已成為威脅我國人群健康的主要腫瘤。由于該病起病較為隱匿，早期癥狀不典型，多數患者臨床確診時已處于進展期，錯過了最佳的治療時機，雖然現有的診療手段不斷提高，但患者總體預后不佳，5年生存率較低[2]。有研究指出[3]，結直腸癌發病是一個涉及眾多因素、眾多步驟的復雜過程，深入探討其發病機制對該病早期診斷及治療具有重要意義。長編鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)作為近年來腫瘤發生機制研究中的一個重要方向，已被證實在多種惡性腫瘤發生及進展中發揮重要作用[4]。LncRNA-被轉化生長因子β激活(LncRNA-activated by transforming growth factor-β，LncRNA-ATB)作為首個發現的可被轉化生長因子激活的LncRNA，在多種惡性腫瘤組織中表達異常，且與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲轉移等生物學行為密切相關[5]，有研究指出[6]，LncRNA-ATB是原發性肝癌新型預后標志物和治療靶點。本研究通過檢測結直腸癌組織中LncRNA-ATB表達，分析其在不同臨床病理指標間的表達差異性，探討其與患者預后的相關性，以期為結直腸癌機制研究提供參考資料。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1臨床資料 選取2012年4月至2014年4月在我院行手術切除治療的結直腸癌患者，納入標準：①術前未行放化療，術后病理證實為結直腸癌；②臨床資料完整，且均能完成院外隨訪。共117例，其中，男性64例，女性53例，年齡32-78歲，平均年齡(56.82±10.63)歲，腫瘤部位：結腸62例，直腸55例；根據國際抗癌聯盟(Union for International Cancer Control，UICC)第七版TNM分期標準：Ⅰ期18例，Ⅱ期45例，Ⅲ期54例；發生淋巴結轉移48例。術中留取結直腸癌組織及癌旁組織(距離腫瘤邊緣>5 cm)，用預冷鹽酸緩沖液(PBS)沖洗干凈后，凍存于-80℃冰箱。本研究通過醫院倫理委員會批準，所有患者均行知情同意。

1.1.2主要試劑和設備 總RNA提取試劑(Trizol法)購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自瑞士Roche公司，擴增試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，引物序列由上海生工生物公司設計合成，島津2450型紫外分光光度計購自江蘇萬科科教儀器有限公司，LightCycler 480熒光定量PCR儀購自瑞士Roche 公司。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR術檢測結直腸癌和癌旁組織中LncRNA-ATB表達 取結直腸癌和癌旁組織，剪碎后，研磨，加入細胞裂解液。利用總RNA提取試劑(Trizol法)提取組織中總RNA，使用紫外分光光度計檢測總RNA純度，以A206/A208在1.80-2.20為合格。按逆轉錄試劑盒說明將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，使用熒光定量PCR儀按擴增試劑盒說明擴增引物。LncRNA-ATB序列：上游：5’-CTTCACCAGCACCCAGAGA-3’，下游：5’-AAGACAGAAAAACAGTTCCGAGTC-3’；β-actin序列：上游：5’-CACCCGTCTTCAGGGCTTCTTGGTTT-3’，下游：5’-CATTTCACCATCTGGTTGGCTGGCTC-3’。PCR條件：95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循環45次，每個樣品設復孔6個。采用2-△△Ct法計算組織中LncRNA-ATB表達量。

1.2.2病例隨訪 所有患者于院后隨訪，隨訪形式包括門診復查、電話短信、住院病歷搜集等，隨訪開始時間為術后第1天，截止日期為2019年4月30日。以死亡為終點事件，記錄患者總生存時間。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 結直腸癌和癌旁組織中LncRNA-ATB表達

LncRNA-ATB在結直腸癌組織中相對表達量為(2.26±0.20)，高于癌旁組織的(1.00±0.12)，差異有統計學意義(t=57.756，P<0.001)。

2.2 LncRNA-ATB在不同臨床病理特征結直腸癌患者組織中表達

LncRNA-ATB在不同性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤部位的結直腸癌組織中相對表達量無差異(P>0.05)；LncRNA-ATB在浸潤深度漿膜及漿膜外、低分化、TNM分期Ⅲ期、發生脈管浸潤及淋巴結轉移的結直腸癌組織中相對表達量高于浸潤深度漿膜下、中高分化、TNM分期Ⅰ-Ⅱ期、未發生脈管浸潤及淋巴結轉移，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 LncRNA-ATB在不同臨床病理特征結直腸癌患者組織中表達

2.3 LncRNA-ATB表達對結直腸癌患者預后的影響

患者隨訪時間7-84個月，中位隨訪時間35.0個月。以LncRNA-ATB表達量的P25值為界值，將患者分為低表達組(n=32)和高表達組(n=85)，Kaplan-Meier生存分析結果顯示，低表達組患者平均生存時間(62.84±5.58)個月，累積生存率68.75%，分別高于高表達組的(41.18±3.27)和32.94%，Log-Rank檢驗差異有統計學意義(χ2=9.028，P=0.003)，見圖1。

圖1 Kaplan-Meier法分析LncRNA-ATB表達對結直腸癌患者預后的影響

2.4 結直腸癌患者預后的影響因素分析

Cox比例風險回歸模型結果顯示，脈管浸潤(HR=2.137，P<0.05)、淋巴結轉移(HR=2.230，P<0.05)和LncRNA-ATB表達(HR=2.208，P<0.05)均是患者預后的獨立影響因素，見表2。

表2 影響結直腸癌患者預后的多因素分析

3 討論

結直腸癌發生及進展過程復雜，涉及多條信號通路異常調控及眾多基因異常表達，具體機制尚未完全清楚。隨著以手術為主的綜合治療方案的應用，多數結直腸癌患者生存率及生存質量有所提高，但術后易發生復發及轉移[7]，在一定程度上影響了生存時間，患者總體預后依然不理想。研究表明[8]，腫瘤復發及轉移是多因素、多階段、涉及眾多基因異常表達及調控的復雜演變過程。因此，積極探討與結直腸癌復發轉移相關的敏感基因對指導患者早期診療及改善預后具有重要意義。LncRNA-ATB屬于LncRNA家族成員，是一種可被TGF-β活化的LncRNA，有研究指出[9]，TGF-β活化LncRNA-ATB可促進肝細胞癌的侵襲轉移。亦有研究指出[10]，TGF-β1上調LncRNA-ATB促進甲狀腺癌細胞遷移和侵襲。Xiao等[11]指出，LncRNA-ATB可促進腫瘤增殖、遷移和侵襲，從而促進腫瘤進展。本研究結果顯示，LncRNA-ATB在結直腸癌組織中相對表達量高于癌旁組織，說明結直腸癌組織中LncRNA-ATB呈高表達，LncRNA-ATB表達異常可能參與了結直腸癌發生過程。本研究結果顯示，LncRNA-ATB在浸潤深度漿膜及漿膜外、低分化、TNM分期Ⅲ期、發生脈管浸潤及淋巴結轉移的結直腸癌組織中相對表達量顯著升高，說明LncRNA-ATB可能參與了結直腸癌侵襲、轉移等惡性化進展過程。

張立冬等[12]指出，LncRNA-ATB在膀胱癌組織中呈高表達，且與預后相關。有研究指出[13]，LncRNA-ATB可作為膠質瘤預后診斷的標志物及潛在治療靶點。亦有研究指出[14]，LncRNA-ATB的高表達與腎細胞癌患者預后不良有關。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，低表達組患者平均生存時間及累積生存率均高于對照組，說明LncRNA-ATB高表達的患者生存時間及生存率顯著降低，提示LncRNA-ATB高表達與結直腸癌患者不良預后有關。Cox比例風險回歸模型結果顯示，LncRNA-ATB陽性表達是患者預后的獨立影響因素，進一步說明LncRNA-ATB表達與結直腸癌患者預后有關，是影響患者預后的風險因素。

綜上所述，結直腸癌組織中LncRNA-ATB呈高表達，且與患者惡性臨床指標及不良預后有關，是影響患者預后的獨立風險因素，有望成為患者靶向治療及預后評估的生物學指標，但其具體作用機制，尚待進一步開展分子細胞學研究予以明確。