結核分枝桿菌耐藥機制的研究進展

王 慧，劉思潔，齊 鵬，劉 昕，黃 飚，楊修軍，吳東林

(吉林省疾病預防控制中心，吉林 長春130000)

迄今為止，結核病依然是全球范圍內重要的傳染病以及重大公共衛生問題。世界衛生組織(WHO)2018年全球結核病報告顯示，2017年全球新增結核病人1000萬例，同時因病死亡的人數高達160萬。估計2017年全球共新增55.8萬耐利福平的結核病人，其中，有五分之四的病人為耐多藥結核病人。有23萬例利福平耐藥以及耐多藥結核病病人致死，耐藥致使的結核病的死亡比例遠大于普通結核病的平均死亡比例[1]。

耐多藥結核病(MDR-TB)，是由對利福平以及異煙肼這兩種藥物耐藥的結核分枝桿菌所導致的疾病，廣泛耐藥結核病(XDR-TB)，是對利福平以及異煙肼出現耐藥，并且對卡那霉素，卷曲霉素以及阿米卡星中其中的一種出現抗藥特征。這些耐藥菌亞群的出現給治療該疾病帶來了全新的挑戰。近年來，由于分子生物學以及生物信息學學科的不斷發展，讓我們對該菌的耐藥性的分子機制方面有了更深層次的認識和理解，本文將對幾種治療結核病的一線藥物出現耐藥性的分子機制進行論述和總結。

1 利福平

利福平是是一種利福霉素衍生物，1972年開始用于抗結核治療。它是最有效的抗結核抗生素之一，與異煙肼一起構成了結核病多藥治療方案的基礎。該藥不僅對生長期的結核桿菌有效，對處于休眠狀態的結核菌也有拮抗作用[2]。利福平的作用模式是通過結合結核分枝桿菌RNA聚合酶的β亞單位，從而阻礙信使RNA的延伸[3]。多數耐該藥的結核分枝桿菌攜帶編碼RNA聚合酶β亞單位的rpoB基因突變，致使RNA聚合酶亞基構象發生變化，降低了對藥物的親和力，致使出現對利福平耐藥的情況[4]。

在rpoB基因上有被叫做利福平耐藥決定區的81-bp的熱點區域，對應編碼氨基酸507-533。有文獻報道在96%利福平耐藥的結核分枝桿菌中，其熱點區存在突變[5]。最常見的利福平耐藥突變是516，526以及531位氨基酸的突變[6,7]。有少量研究也注意到在熱點區域外發生的導致利福平耐藥的突變[8]。值得注意的是，單純對利福平的耐藥情況非常罕見，幾乎所有利福平耐藥菌株也對其他藥物特別是異煙肼具有抗性，因此可將利福平耐藥視為耐多藥菌株的標志性特征[9]。

2 異煙肼

異煙肼1952年作為抗結核藥物被引入，它與利福平聯合用藥，是目前公認最佳的治療方法。不同于利福平，該藥僅對代謝活躍的結核分枝桿菌起作用。異煙肼在結核分枝桿菌體內，需要經過katG基因編碼的過氧化氫酶-過氧化物酶KatG激活才能發揮治療的作用[10]。該藥通過影響inhA基因編碼的enoyl-ACP還原酶活性，抑制分枝菌酸的合成，從而發揮作用[11]。

該藥存在兩種主要耐藥機制，均涉及katG與inhA及其啟動子區域的基因突變，已被許多相關研究所證實[12]。最常見的突變為katG基因中的S315T突變，致使過氧化氫酶-過氧化物酶活性有所減弱，無法形成發揮其抗菌功能所需的活性產物[13]，該突變導致對異煙肼的高度耐藥(最小抑菌濃度MIC>1 μg/mL)，并且更常見于MDR菌株中[14]。inhA的突變通常發生在啟動子位置，可致使InhA產物過度表達，其濃度超出藥物抑制范圍而出現耐藥現象；inhA的突變也可發生在活性位點，降低了其對異煙肼活化產物的親和力[13]。最常見的突變位于-15C/T位置，該突變導致對異煙肼的低水平抗性(MIC<1 μg/mL)。 inhA的突變不僅對異煙肼具有抗性，而且對結構相關的藥物乙硫異煙胺也具有抗藥性[15]。

3 乙胺丁醇

乙胺丁醇在1966年引入 TB 治療，現在仍是該疾病的一線治療方案的重要部分。該藥物可干擾細菌細胞壁胞壁多糖的合成從而抑制細菌繁殖[16]，阿拉伯糖基轉移酶是該藥物作用的靶點。該酶由embC、embA、embB三個編碼，embB基因突變與乙胺丁醇耐藥相關。耐藥株embB306位置普遍出現突變，致使該酶結構出現變化，乙胺丁醇親和能力下降，發生了耐藥的情況[17]。但是，一些研究經過實驗證實，在該藥物的敏感菌株里面也發生了embB306突變的現象[18]。一項大規模研究的結果表明，embB306突變與其說是乙胺丁醇耐藥的充分條件，不如說反映了對多種結核治療藥物的耐藥形成傾向[19]。普遍認為embB306突變可能是該藥物耐藥特性的重要前提之一，但只有embB306突變，并不能導致結核桿菌對于乙胺丁醇的高強度抗性。此外仍有約30%的乙胺丁醇耐藥菌株，其embB 中沒有出現任何改變[20]，表明需要確定其他可能的耐藥機制。

4 吡嗪酰胺

吡嗪酰胺是煙酰胺的一種類似物，上世紀50年代早期被引入結核病治療中，現在已成為重要的一線治療藥物，使用該藥物可使治療時間縮短到6個月。它可抑制酸性環境中的半休眠桿菌，例如在結核病灶中的細菌[21]。吡嗪酰胺需要通過吡嗪酰胺酶(pncA基因編碼)轉化為吡嗪酸才具有抗菌活性[22]。該藥物經被動擴散進入菌體，形成吡嗪酸后，再經外排機制排出膜外。在膜外的酸性條件下，形成質子化的吡嗪酸被重新吸收到細胞內，并因外排泵效率低而在細胞內積聚，導致細胞出現損傷[23]。研究還發現，吡嗪酸及其正丙酯可通過抑制結核桿菌中的Ⅰ型脂肪酸合成酶而實現抗菌功能[24]。

吡嗪酰胺抗性菌株中最常見的的突變發生在pncA中，突變可使酶活性降低甚至失活。雖然這些突變分散在整個基因中，但大多數局限于561bp的開放閱讀框區域以及82 bp的啟動子區域[25]。一些研究報告，部分耐藥菌株pncA內未出現突變，說明抗性可能是由于另一個尚未鑒定的調控基因的突變所致[26]。但據目前的證據，編碼核糖體蛋白S1的rpsA突變尚不能完全解釋藥物抗性[27]，需要進一步研究耐藥相關的分子靶標。

5 鏈霉素

鏈霉素起初從灰色鏈霉菌中分離出來，是最早用于抗結核治療的抗生素。鏈霉素單獨治療結核病很容易出現耐藥，目前常常與利福平、異煙肼等藥物聯用[28]。鏈霉素是一種對活躍生長的桿菌具有殺傷作用的氨基環醇糖苷，通過與核糖體蛋白S12和16S RNA亞基發生相互作用抑制蛋白質的翻譯，核糖體蛋白S12和16S RNA亞基分別由基因 rpsL 和 rrs 所編碼[29]。因此，rpsL和rrs基因突變是產生鏈霉素抗性的主要機制，在 rpsL突變株中，43位密碼子賴氨酸突變為 精氨酸是最常被報道的，這種突變對鏈霉素產生高水平的抗性；在rrs突變株中，最常見的突變發生在核苷酸530和915周圍[30]。與鏈霉素耐藥有關的還有編碼m7G甲基化轉移酶的gidB基因，該基因的突變導致16S RNA上保守的 m7G甲基化修飾丟失，從而產生對鏈霉素的低水平耐藥[31]。

上述幾大類別一線藥物對該細菌產生耐藥的機制里面，雖然幾種典型的遺傳物質突變和該細菌的耐藥程度有著顯著的聯系，但仍存在許多不具有這些經典突變的抗性菌株。發現新的耐藥基因以及耐藥分子機制還是該疾病診治過程中最不可忽視的一大問題。鑒于耐多藥結核病發病比例逐漸增加，研發新型的治療該疾病的藥物變得迫在眉睫，所以，更深入的研究該細菌的耐藥性出現的分子基礎就變得不可忽視了。