FOXA家族在惡性腫瘤中的作用研究進展

張偲昂，王明東，王 澤，陳文杰，金煜翔，趙學維，薛 磊

FOX家族被稱之為叉頭框(fork-head box)蛋白，其特征是具有一段長度為110個氨基酸，高度保守并且和果蠅叉頭基因相應區域高度同源的DNA結合域。根據叉頭框的序列可進一步分為FOXA～FOXS共19個亞族。FOXA家族最初從大鼠肝核細胞中提取，在2000年系統命名叉頭框家族之前被稱作肝核轉錄因子-3(hepatic nuclear factor-3，HNF-3)，包括FOXA1、FOXA2、FOXA3三個成員。FOXA家族的特征性叉頭框結構由3個α螺旋及其兩側2個環形結構組成，又被稱為“旋翼區”(wing-helix domain，WHD)。值得注意的是，FOXA的C末端能與組蛋白H3、H4相互作用，且旋翼區在結構上類似于組蛋白H1，該結構有助于FOXA與致密的染色質結合并使之松散。除FOXA本身的DNA結構域與染色質結合發揮作用外，其也可進一步促進染色質與其他轉錄因子結合從而發揮下游作用。因此，FOXA也被稱為“先鋒因子”。FOXA家族成員是內胚層形成以及相關器官如肝臟、胰腺、肺和前列腺等的正常發育所必須的，其還可以通過調節肝臟、胰腺和脂肪組織中的多個靶基因以調控能量代謝從而參與許多疾病的發生、發展過程[1]。此外，FOXA家族更是和惡性腫瘤的發生、發展以及轉移等各個環節息息相關。目前關于FOXA1和FOXA2的研究較多，而針對FOXA3的研究較少，且多集中于胚胎發育、血糖、脂肪的代謝及相關疾病等方面。值得注意的是，在不同的腫瘤疾病進程中，FOXA家族各成員的表達及其作用并不相同，筆者就近年來FOXA家族與惡性腫瘤的相關研究進行綜述。

1 FOXA在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的作用

Wang等[2]系統地利用人肺腺癌A549細胞株的染色質免疫共沉淀技術(chromatin-immunoprecipitation, ChIP)結合二代測序即ChIP-Seq(ChIP-sequencing)數據，分析了多個轉錄因子結合位點，發現FOXA1作為一種重要的轉錄因子可能在肺癌轉移起始階段起重要作用，其可負性調節腫瘤的上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。該研究還發現在FOXA2啟動子區有一個強的FOXA1結合位點，提示在A549細胞中存在FOXA1對FOXA2的潛在調控。Li等[3]研究發現，FOXA1在高侵襲性的A549細胞中表達升高，且相對于腫瘤原發灶，其在轉移淋巴結中的表達更高。此外，在A549細胞系中干擾FOXA1可以抑制細胞的增殖并降低其侵襲、遷移能力。Deutsch等[4]研究發現在肺鱗狀細胞癌中FOXA1也同樣起致癌基因的作用，其在肺鱗狀細胞癌中的表達與遠處轉移以及較差的預后有關，并且相比于未匹配原發腫瘤的腫瘤樣本，在肺鱗癌患者腦轉移標本中FOXA1的表達量較高。

FOXA2在肺癌中被認為是抑癌基因，過表達FOXA2可抑制肺癌細胞轉移，促進其凋亡。Basseres等[5]利用免疫組化方法檢測了173例原發NSCLC組織中的FOXA2表達情況，結果發現42例(24.2%)中FOXA2表達缺失，54例(31.2%)中低表達。Halmos等[6]發現FOXA2是抑癌基因C/EBPα的下游靶基因，且FOXA2在正常肺中表達強烈，但在所有肺癌細胞系中半數以上(15/25)表達消失。在人非小細胞肺癌NCI-H358細胞株中過表達FOXA2后，細胞增殖停滯，增殖克隆能力喪失，同時促進細胞凋亡。鋅指轉錄因子Slug，又稱為snail2，主要通過調控增加E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達從而使細胞維持正常上皮的特征以參與EMT。Tang等[7]研究發現FOXA2能夠與Slug啟動子結合后通過自身的轉錄激活域Ⅱ抑制Slug的轉錄，下調人肺癌細胞中FOXA2可以誘導腫瘤細胞發生EMT，反之FOXA2過表達則可以抑制EMT，進一步影響肺癌細胞的轉移。此外，有研究通過對各公共數據庫數據的分析，認為FOXA1和FOXA3在肺癌組織及細胞株中高表達，而FOXA2表達較低，并且三者均與較差的預后相關[8]。

2 FOXA在乳腺癌中的作用

乳腺癌是一類高度異質性的腫瘤，其分子分型包括Luminal A型、Luminal B型、人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor，HER)-2過表達型、基底細胞樣型(三陰型乳腺癌屬于此型)。FOXA1在乳腺癌細胞株中普遍高表達，這在雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性(Luminal A/B型)的乳腺癌患者中通常意味著更好的預后。一項研究分析了4 444例乳腺癌患者樣本后發現FOXA1還與一些腫瘤臨床預后較差的指標呈負相關，如腫瘤大小、分級，Ki67蛋白和HER-2蛋白的表達，基底細胞樣亞型等，提示FOXA1是估計乳腺癌預后的獨立危險因素[9]。究其原因，FOXA1是影響ER與染色質相互作用的決定性因素。Hurtado等[10]利用ChIP-Seq手段發現在同一種乳腺癌細胞系中，ER結合位點與FOXA1結合位點之間的重疊區域可達52%～58%。FOXA1作為基因轉錄調節的先鋒因子，可以結合并松解位于重疊區域的致密核小體，進而利于ER與配體的結合。在接下來的乳腺癌MCF-7細胞株研究中發現，人為沉默FOXA1基因后，與對照組相比超過90%的ER結合位點信號強度至少降低了50%。研究還發現在雌激素敏感的乳腺癌細胞中，FOXA1的存在為他莫昔芬-ER結合所必須(他莫昔芬為抗雌激素藥物，結構類似雌激素，能與雌二醇競爭ER并與之形成穩定的復合物)；而在他莫昔芬耐藥細胞中，ER結合與配體無關，但同樣依賴于FOXA1的存在。

對于ER陰性的乳腺癌，Ni等[11]利用了乳腺分子大汗腺型腫瘤(molecular apocrine tumours)的MDA-MB-453細胞系作為模型進行研究，這類細胞系的分子表型為ER(-)/雄激素受體(androgen receptor，AR)(+)/HER-2(+/-)，其信號調節和雄激素依賴性與前列腺癌細胞系類似。結果發現AR可以通過上調WNT7B分子的表達激活Wnt/β-catenin信號通路，隨后誘導HER-3上調。HER-3與HER-2均為HER家族成員，它們可以形成異源二聚體并磷酸化觸發信號級聯從而促進腫瘤細胞的生長。Robinson等[12]研究發現AR發揮功能是依賴于FOXA1的，因為沉默FOXA1的表達后可以抑制AR的結合。此外，FOXA1還可以通過調控細胞周期對細胞生長產生抑制作用。一項研究通過對乳腺癌細胞株MCF-7和ZR-75-30運用ChIP技術證實FOXA1能結合到p21、p27基因啟動子序列上，再通過克隆p21、p27的啟動子，構建p21、p27啟動子重組質粒進行共轉染實驗，結果提示FOXA1能促進p21、p27基因的轉錄[13]。Wolf等[14]也同樣發現，FOXA1可以通過調控p27的轉錄來實現對乳腺癌細胞增殖的調控。除了被廣泛研究的FOXA1，FOXA2在乳腺癌的發生、發展中也同樣發揮著重要作用。Zhang[15]研究發現FOXA2可以通過促進E-鈣黏蛋白并抑制E盒結合鋅指蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2, ZEB2)表達的方式，抑制乳腺癌EMT的發生從而產生抑癌作用。Cao等[16]經研究認為，過氧化物酶體-γ共激活因子-1β(peroxisome gamma coactivator-1β, PGC-1β)的下調與FOXA2的過度表達可以通過調節PI3K-AKT-mTOR途徑共同抑制乳腺癌細胞的功能。但也有研究卻發現FOXA2可以促進基底細胞樣型乳腺癌的發生，并增加復發率[17]。

3 FOXA在前列腺癌中的作用

FOXA1也可以通過調控AR所介導的轉錄過程從而在前列腺癌的發生、發展及轉移中發揮作用。與乳腺癌不同的是，盡管同樣是激素依賴性的腫瘤，FOXA1高表達卻往往表示腫瘤預后不佳。Jain[18]通過對80例原發性和28例轉移性前列腺癌組織研究(包括15對配對樣本)，發現89%的轉移性前列腺癌標本FOXA1高表達，相比之下原發灶僅有19%FOXA1高表達，并且FOXA1高表達與腫瘤大小、前列腺外浸潤及淋巴結轉移程度呈正相關。馮偉等[19]運用免疫組化的方法檢測了35例前列腺癌以及21例良性前列腺增生的組織標本，發現前列腺癌組織中FOXA1的表達顯著高于良性前列腺增生組織，并且FOXA1與前列腺癌患者的TNM(tumor node metastasis)分期、Gleason評分正相關，也說明FOXA1在前列腺癌中扮演著促癌基因的角色。此外，FOXA1/A2還可以促進AGR2蛋白(anterior gradient protein 2)的表達，而AGR2可以增加前列腺癌細胞的侵襲性。ErbB3結合蛋白1(ErbB3-binding protein 1, EBP1)可以拮抗FOXA1/A2的誘導，抑制AGR2的表達，從而減弱腫瘤細胞轉移的能力。

4 FOXA在肝細胞癌中的作用

女性的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)明顯低于男性，諸多研究已經證明雌激素對肝細胞具有保護作用，而雄激素相反可促進肝細胞癌的發生。FOXA1/A2為建立前腸內胚層和啟動肝臟發育所必須。Li等[20]利用二乙基亞硝胺誘發FOXA1/A2基因缺陷的小鼠肝癌，結果發現雌性FOXA1/A2缺陷型小鼠腫瘤較對照組明顯增大，而雄性FOXA1/A2缺陷型小鼠較對照組腫瘤較小，即失去了肝癌致病過程的兩性差異。進一步的研究發現FOXA1/A2和ER或AR對靶基因的共調控在正常雌性或雄性小鼠的肝癌發生過程中分別增加，但這種共調控在FOXA1/A2缺陷型小鼠中并不存在。因此，雌激素對HCC的抵抗作用和雄激素對HCC的促進作用均取決于FOXA1/A2。有研究認為，FOXA1作為腫瘤抑制因子可以直接抑制PIK3R1(phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 1)基因的轉錄活性，PIK3R1基因負責編碼磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)的p85α亞基，FOXA1正是通過此種機制抑制PI3K/Akt信號傳導，從而對男性患者HCC的增殖、遷移和侵襲產生負面調節作用[21]。Wang等[22]發現FOXA2在肝癌組織中表達降低，進一步體外、體內的試驗均證實了FOXA2可以抑制HCC的侵襲和轉移。研究還發現FOXA2可下調基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9, MMP-9)的表達，提示FOXA2可能是因此抑制肝癌轉移。MMP-9屬于基質金屬蛋白酶家族一員，是一類結構中含Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶，被認為是腫瘤發生侵襲轉移的始動因素。Liu等[23]發現腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)的一個重要的下游激酶IκB激酶的α亞基(IKKα)可以使FOXA2發生磷酸化而失活，導致NUMB蛋白表達降低并進一步激活下游NOTCH通路，促進細胞增殖和腫瘤發生。肝癌細胞中FOXA2，IKKα和活化的NOTCH1蛋白(NOTCH1是NOTCH基因編碼的一種跨膜蛋白受體，與惡性腫瘤的發生、發展關系密切)水平顯著高于正常肝組織，并且FOXA2分別與IKKα和活化的NOTCH1蛋白表達呈正相關，由此參與炎癥介導的肝細胞癌致病過程。此外，汪子力[24]發現FOXA2可以通過調節p53和p21的轉錄影響肝癌細胞增殖。李正平等[25]研究發現FOXA2可以調節E-鈣黏蛋白的表達并進一步調節EMT從而發揮抑癌的作用。最新的研究還發現FOXA2抑制另一叉頭框蛋白FOXM1的表達進而抑制其誘導的致瘤作用，還可抑制Ras基因誘導的涉及FOXM1的肝癌進展[26]。FOXM1對HCC的發展至關重要，其過表達與不良預后相關。反之FOXM1也可以抑制FOXA2的表達，兩者在HCC的進展中扮演相反的角色。

5 FOXA在胰腺癌中的作用

FOXA1和FOXA2，對于許多內胚層衍生器官(包括胰腺)的上皮分化至關重要。Song等[27]研究發現在人胰腺導管癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDA)樣本中，FOXA1/A2在從正常到分化良好的所有癌細胞的上皮細胞中均表達，而在未分化癌細胞中表達丟失。在PDA細胞系中，不管抑制FOXA1或FOXA2，均可以誘導胰腺導管癌細胞發生EMT，而過表達FOXA2可以重新激活E-鈣黏蛋白從而維持正常上皮的表型。通過對胰腺未分化癌細胞的研究發現，這種作用實際上是通過去甲基化重新激活內源性的FOXA2而實現的。因此，FOXA1/A2與胰腺癌轉移密切相關。

6 FOXA在食管癌中的作用

研究發現FOXA1在食管癌中高表達并與廣泛的淋巴結轉移有關。此外，有研究發現FOXA2在Barrett食管、食管異型增生以及食管腺癌中表達上調[28]。Watts[29]研究顯示，FOXA2可以通過調節X1因子(regulatory factor X1, RFX1)的表達水平從而在Barrett食管向食管腺癌發展的過程中起到一定作用。Chen等[30]對FOXA3在食管癌中的作用進行了研究，結果提示FOXA3在食管癌及Barrett食管中高表達，下調FOXA3后腫瘤的侵襲轉移能力受到抑制。研究還發現FOXA1/A2的表達水平也隨之下降，而過表達FOXA1或FOXA2后，食管癌細胞的侵襲轉移能力也得到恢復。

7 FOXA在結直腸癌中的作用

Ma等[31]通過對90例結直腸癌組織標本的研究，發現FOXA1的陽性表達與腫瘤體積、淋巴結轉移及更晚的腫瘤分期有關，并且是預后不良的獨立危險因素。最近有一項對多達403例結直腸癌組織標本的研究，也證實了FOXA1與腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結轉移、更晚的腫瘤分期和低生存率相關，并且FOXA1陽性腫瘤的平均Ki-67指數值顯著高于FOXA1陰性腫瘤[32]。體外細胞實驗發現敲除FOXA1后可以激活ADP-核糖聚合酶，上調p53基因，下調BH3和Mcl-1蛋白，從而抑制了腫瘤細胞侵襲，同時誘導細胞凋亡。這些結果表明在結直腸癌中FOXA1可以通過調節細胞生存數量以促進腫瘤的發展。此外，在結直腸癌中，FOXA與上皮標記基因的增強子相關，在維持正常上皮結構功能中發揮著重要作用[33]。Snail1(鋅指轉錄因子的成員之一)可以通過直接抑制FOXA1并觸發所有FOXA家族成員的下調，從而促進EMT的發生。

8 FOXA在其他腫瘤中的作用

FOXA1在甲狀腺未分化癌中高表達并被認為是潛在的致癌基因。有研究利用免疫組化技術檢測了67例甲狀腺髓樣癌(包括1例降鈣素陰性髓樣癌)標本，結果所有67例標本中FOXA1均是強陽性表達[34]。Kim等[35]研究顯示甲狀腺乳頭狀癌細胞中FOXA2的表達明顯下降。在腦膠質瘤中，FOXA1的表達與不良預后相關并可促進腫瘤的增殖及轉移[36]。相反，FOXA2則可以抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲性[37]。FOXA2還可以抑制卵巢癌和胃癌的增殖、遷移侵襲能力[38]。此外，研究發現FOXA2在子宮惡性腫瘤包括子宮肉瘤中存在頻繁突變，提示FOXA2可能也參與了子宮惡性腫瘤的致癌進程[39]。

9 總結與展望

綜上所述，FOXA家族與惡性腫瘤的發生、發展密切相關，且在不同的腫瘤中，FOXA家族基因的表達及其作用均不相同。FOXA因其與ER、AR密切的作用關系，在乳腺癌、前列腺癌以及肝癌這類激素相關性腫瘤的致病機制中扮演了核心的角色。從HNF-3到叉頭框蛋白A已經有20年，期間研究者們進行了不懈的努力，對其在各種惡性腫瘤中的作用及機制不斷探索，相信通過今后對FOXA家族研究的進一步深入，能為腫瘤的診治帶來新的收獲。