心臟代謝疾病生物標志物骨保護素的中西醫研究進展

鄧林華，陳善夫，李 娟，趙英強，柳 威

心血管疾病是人類死亡的主要原因之一，占全因死亡率的32%[1]。隨著人口老齡化加劇，因心血管疾病的死亡人數不斷升高，2020年心臟代謝疾病如動脈粥樣硬化和糖尿病成為全球疾病負擔的主要原因。因此，檢測心血管疾病早期標志物并及時干預顯得尤為重要。近年來，腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族在心血管疾病潛在生物標志物眾多分子中受到極大關注，該家族成員包括骨保護素及其配體，他們是核轉錄因子κB(NF-κB)配體(RANKL)和TNF相關凋亡誘導配體(TRAIL)的受體激活劑。骨保護素/RANK/RANKL信號通路是調節骨形成和骨吸收平衡的關鍵，可誘導骨重建并調節破骨細胞分化和活化[2]。有研究顯示，骨調節蛋白和血管生物學之間存在密切關系，血管鈣化與骨重建是一種包括誘導和抑制的主動調節過程，血管鈣化病人發生不良心血管事件風險較高[3]，且有證據表明，骨保護素在心臟代謝性疾病中作用可能是重要的[4]。

1 骨保護素和TNF相關凋亡誘導配體作為心臟代謝疾病生物標志物的結構和功能

1.1 骨保護素的結構和生物學功能 骨保護素最初是從人成纖維細胞培養基中純化，且Tsuda等[5]將骨保護素描述為破骨細胞生成抑制因子(OCIF)，由于其具有抑制骨重吸收的能力稱為骨保護素。骨保護素是TNF受體超家族的細胞因子，由TNFRSF11B基因編碼，其包含7個結構域，結構域1～4富含半胱氨酸并與TNF受體細胞外結構域具有結構相似性，且足以消除破骨細胞生成；結構域5和6包含死亡結構域，其與Fas和TRAIL死亡受體具有相似性；結構域7是由50個氨基酸組成的，含有對二硫鍵形成和骨保護素二聚化必需的cys-400殘基[6]，在骨保護素釋放和活性調節方面發揮重要作用[7]。分泌骨保護素單體和二聚體形式之前，21a信號肽從N-末端切割，產生380aa成熟的骨保護素蛋白。循環骨保護素作為60 kD游離單體和120 kD二硫鍵連接的同型二聚體形式或作為與其配體RANKL和TRAIL結合的骨保護素形式存在。

骨保護素在體內由內皮細胞、血管平滑肌細胞(VSMC)和成骨細胞表達。骨保護素通過免疫組織化學在主動脈和冠狀動脈粥樣硬化斑塊內或血管平滑肌細胞周圍可檢測到[8-9]。炎性因子、激素和各種循環化合物刺激時，內皮細胞在基礎條件下釋放骨保護素。炎性因子如TNF-α和白細胞介素(IL)-1β可增加骨保護素的表達水平。內皮細胞內骨保護素與Weibel-Palade體(WPB)分泌顆粒的血管性血友病因子(vWF)相關。vWF多聚體大小可通過糖蛋白血小板反應蛋白-1(TSP-1)控制。TSP-1從內質網內發揮作用，激活核因子E2相關因子2(Nrf2)，誘導針對脂毒性應激的保護性抗氧化防御反應[10]。有研究表明，骨保護素是脂肪干細胞(ASCs)釋放的保護因子之一，有助于ASC介導的心臟保護作用[11]。雖然骨保護素介導的細胞保護機制尚未完全闡明，但已明確升高的骨保護素與炎癥標志物、內皮功能障礙、氧化應激和心血管疾病密切相關[12]。

1.2 RANK/RANKL的結構和生物學功能 人類RANK是由616個氨基酸組成。這些氨基酸分為383個氨基酸的C末端細胞質結構域、184個氨基酸的N-末端細胞外結構域、28個氨基酸的信號肽和21個氨基酸的跨膜結構域，其包含4個半胱氨酸和2個N-糖基化位點，是一種在破骨細胞前體細胞上表達的1型同源三聚體跨膜蛋白。RANKL是一種在成熟成骨細胞上表達的2型同源三聚體跨膜蛋白，以可溶形式(sRANKL)在血液中循環。RANKL連接至RANK的下游信號傳導的關鍵預備步驟是TNF受體相關因子(TRAF：2，5，6)與RANK細胞質結構域中特定位點結合，從而激活NF-κB激酶(IκB)/NF-κB和AP-1等相關信號通路。在內皮細胞的細胞核中，骨保護素與RANK/RANKL結合，通過NF-κB和AP-1誘導細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細胞間黏附分子-1(VCAM-1)表達并促進白細胞黏附，這是內皮細胞功能障礙的早期表現。RANK-RANKL-骨保護素和其他調節蛋白是血管鈣化進展的主要途徑，骨保護素作為RANKL的誘餌受體，通過其N-末端富含半胱氨酸的結構域(CRD)與RANKL結合，從而阻止RANK/RANKL相互作用[13]。RANKL通過與RANK-TRAIL結合產生多個細胞內信號。

1.3 TRAIL的結構和生物學功能 TRAIL又稱為Apo2L，是TNF相關的凋亡誘導配體，其負責外源性誘導細胞死亡。TRAIL表達為Ⅱ型跨膜蛋白，在生理學方面以生物活性的可溶性三聚體形式存在，結構方面與CD95L和TNF相關。人類TRAIL包括4種跨膜受體：死亡受體4(DR4，TRAIL-R1)、DR5(TRAIL-R2)、誘餌受體1(DcR1，TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)，第5種是骨保護素。TRAIL/TRAIL-R系統的重要作用是調節細胞凋亡。DR4屬于TNFR超基因家族，含有細胞質死亡域，其誘導細胞凋亡的過程獨立于CD95、TNFR1或FADD發揮作用。骨保護素與TRAIL結合，與TRAIL相互作用并通過腫瘤壞死因子受體超家族成員(TNFRSF)家族中的細胞表面受體死亡受體4(DR4)和DR5抑制腫瘤細胞凋亡[14]。小鼠TRAIL有一個全長受體TRAIL-R(mDR5、mTRAILR2)，與人類DR4和DR5相同。TRAIL與特定死亡受體結合導致另一種形式程序性細胞死亡，稱為壞死性凋亡，其作為病毒防御機制發揮重要作用，細胞以不依賴于Caspase方式進行細胞死亡。

TRAIL及其相關受體分布于廣泛的組織中，包括脾、肺和前列腺等，并由多種細胞類型表達，包括血管細胞、免疫細胞和脂肪細胞。雖然最初認為僅在惡性或轉化細胞中誘導細胞凋亡，但已知TRAIL結合不同的受體以激活信號傳導途徑，包括NF-κB、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、細胞外調節蛋白激酶(ERK1/ERK2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38等，并在非轉化細胞中發揮多效作用。TRAIL在動脈粥樣硬化病變中表達，易損斑塊位點可見其表達水平升高。有研究證實，TRAIL處理的內皮細胞中細胞凋亡增加，而其他組織已顯示相應TRAIL的這些細胞存活和增殖增加，似乎TRAIL在脈管系統內具有多效性，既導致動脈粥樣硬化發生，又存在血管保護的雙重作用[15]。相關研究表明，可溶性TRAIL誘導一些信號轉導途徑的激活，促進VSMCs和內皮細胞存活，通過其抗炎特性和局部一氧化氮(NO)產生進而發揮內皮保護作用[16]。

2 骨保護素在心血管疾病中的作用

2.1 保護內皮功能、抗炎、抗凋亡 內皮是分布不均勻的器官之一。相關研究表明，內皮可能是破壞性致命疾病的起源[17]。內皮包括大量不同表型、功能和位置的內皮細胞亞型，他們具有損傷和/或病理情況(如缺氧或組織損傷)誘導的血管生成因子，形成新的脈管系統能力。內皮細胞代謝活性不同于其他細胞的代謝活性，其細胞生物能量學與氧化線粒體代謝相關。內皮細胞可改變其表型并在不狀態之間轉換-遷移、增殖和靜止。內皮細胞通過有氧糖酵解產生高達85%的三磷酸腺苷(ATP)。不同內皮細胞亞型的糖酵解速率不同。動脈內皮細胞更具氧化性，而微血管內皮細胞糖酵解能力更強。脂肪酸-β-氧化(FAO)分解代謝的脂肪酸(FAs)是胚芽發育過程中內皮細胞的重要物質[18]。高FA可激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-α)，從而增加FAO。心肌細胞中，約70%的ATP由FA氧化產生，FA是主要的能量來源，在這種情況下，內皮細胞發揮關鍵作用。內皮衰老可能在心臟肥大等疾病中發揮重要作用，并在這種狀態下導致葡萄糖代謝增加，FAO減少。內皮細胞和心肌細胞之間存在干擾，代謝適應不良可能損害心臟功能。ATP/腺苷代謝與骨保護素/RANK/RANKL三聯體的功能之間存在密切聯系，人骨祖細胞系研究顯示，腺苷和腺苷受體激動劑抑制骨保護素分泌[19]。體外采用骨保護素處理內皮細胞誘導內皮集落形成細胞(ECFC)的細胞骨架重組。整聯蛋白αvβ3和/或αvβ5有助于骨保護素誘導的內皮細胞增殖和遷移，同時施用這些抗體時，骨保護素誘導增殖受到抑制。骨保護素誘發細胞外信號調節激酶(ERK)1/2的激活，其與整合素αv活性相關[20]。除細胞遷移中的作用外，αvβ3整合素促進刺激內皮細胞存活。這種情況下，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)可調節骨保護素生物利用度，骨保護素可能通過HSPGs/黏結合蛋白多糖-1(syndenan-1)結合進而與ENFC相互作用[21]。另有研究表明，骨保護素通過αvβ3整合素防止人微血管內皮細胞(HMVENs)TRAIL誘導的細胞凋亡[22]。血管緊張素Ⅱ泵入的骨保護素基因敲除小鼠腹腔注射骨保護素，改善心力衰竭進展而不影響收縮壓水平，說明骨保護素在血管緊張素Ⅱ誘導的心臟肥大過程中保持心肌結構和功能的生物活性，可能具有抗細胞凋亡和促纖維化作用[23]。S-氨氯地平可能通過調節RANK/RANKL/骨保護素途徑抑制炎癥并防止內皮功能障礙，RANK/RANKL/骨保護素途徑可能是miR-155的下游[24]。

2.2 改善脂質代謝，保護鈣化血管 RANKL、RANK和骨保護素等因素通過改善脂質代謝參與動脈粥樣硬化的過程。骨保護素基因敲除小鼠中鈣化動脈與骨質疏松癥發展首先揭示骨保護素在血管生物學中的作用，且積累證據支持骨保護素對鈣化的保護作用[25]。已有研究表明，編碼骨保護素的TNFRSF11B基因多態性與類風濕性關節炎病人冠狀動脈粥樣硬化有關[26]。骨保護素顯示在載脂蛋白E(ApoE)-/-小鼠無名動脈晚期動脈粥樣硬化病變的進展和鈣化中具有保護作用，關于ApoE和骨保護素雙重缺乏的老年小鼠發展為復雜的動脈粥樣硬化病變[27]。主動脈瓣狹窄中，瓣膜高密度脂蛋白(HDL)減少。HDL均誘導骨保護素分泌，并在體外降低TNF-α表達[28]。生長因子系統包括VEGF和血小板衍生生長因子(PDGF)，通過內分泌和自分泌/旁分泌機制在脈管系統細胞中發揮作用，這些因子的內皮作用機制是多重的，并已顯示其參與動脈粥樣硬化的發生和發展。有研究顯示，血管細胞中PDGF可上調VSMC中骨保護素表達，而PI3K/Akt信號通路消除了PDGF誘導的骨保護素表達[29]。

3 骨保護素在心血管疾病中的臨床研究

心力衰竭病人與無心力衰竭受試者相比，RANKL(T細胞和血清)和骨保護素(血清)表達增加，表明RANKL表達增加可能是導致左室功能障礙的潛在機制，而骨保護素表達增加可能有助于防止RANKL的有害作用[30]。無癥狀受試者血清RANKL、基質金屬蛋白酶8(MMP-8)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)水平與冠狀動脈鈣化評分(CCS)呈正相關，反映循環RANKL與冠狀動脈鈣化之間的潛在關系，血清RANKL水平可能代表冠狀動脈鈣化和相關心血管風險的潛在生物標志物[31]。一項前瞻性隊列研究顯示，骨保護素與年齡、吸煙、流行性糖尿病、C-反應蛋白、性激素結合球蛋白及尿酸等密切相關，女性骨保護素與高血壓和胎球蛋白-A呈正相關，此外，骨保護素與氨基末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)之間存在聯系[32]。相關研究顯示，骨保護素和TRAIL水平與心房顫動事件及潛在心血管風險顯著相關，急性心房顫動病人初始TRAIL水平與左室射血分數呈正相關，與左心房直徑呈負相關；根據CHA2DS2-VASc評分選擇的亞組中骨保護素增加；竇性心律維持的亞組TRAIL濃度明顯增加；在預測心房顫動發生具有較好的預后價值[33]。高血壓病人骨保護素水平升高，血漿骨保護素和骨橋蛋白(OPN)水平與炎癥和高血壓顯著相關[34]，骨保護素與高血壓病人慢性腎病密切相關[35]。血脂異常和糖尿病均可影響心血管系統骨保護素/TRAIL比值，而這些變化促進動脈粥樣硬化發展和心臟重塑[36]。有研究表明，骨保護素通過增加蛋白多糖和基質金屬蛋白酶(MMPs)水平干擾正確的瓣膜內皮功能[37]，骨保護素參與二尖瓣脫垂(MVP)分離細胞和分子變化，MVP病人循環骨保護素水平升高，表明骨保護素可能參與MVP發展和進展。骨保護素血管鈣化方面作用仍存在爭議，另有研究表明，冠狀動脈疾病和慢性腎病病人血清骨保護素濃度似乎對鈣化無明顯影響[38]。

3 中醫藥通過調控骨保護素治療心血管疾病

已有研究表明，中醫藥通過調控骨保護素/RANK/RANKL信號通路抑制破骨細胞生成進而發揮骨保護作用[39]。骨保護素與心血管疾病人群存在密切關聯已被多項研究證實，但關于中醫藥通過調控骨保護素相關信號轉導從而發揮心血管保護作用研究較少。有研究表明，黃連素可抑制高級糖基化終產物(AGEs)誘導的人主動脈平滑肌細胞(HASMCs)鈣化，其機制可能與下調ERK、p38絲MAPK信號通路導致OPG、OPN、骨形態發生蛋白2(BMP2)表達減少有關[40]。補腎活血湯對抑制由高水平磷酸鹽誘導的VSMC成骨分化具有有益作用，潛在機制可能與VSMC成骨分化過程中上調骨保護素mRNA表達并下調RANKL mRNA表達作用有關，從而阻止VSMCs表型變化為成骨表型[41]。小檗堿可能通過抑制堿性磷酸酶(ALP)和BMP-2通路中BMP-2、骨保護素、骨鈣素(OCN)和與侏儒相關的轉錄因子2(RUNX2)因子緩解血管鈣化，從而間接發揮緩解動脈粥樣硬化作用[42]。桑葉水提取物治療糖尿病大鼠可上調骨保護素表達，下調AGEs、晚期糖基化終產物(RAGE)、NADPH氧化酶4(Nox4)、NF-κB和RANKL表達，從而改善骨的微觀結構和強度，并通過調節AGEs/RAGE/Nox4/NF-κB信號傳導消除氧化應激[43]。

4 小 結

骨保護素作為一種新型的生物標志物，臨床試驗已明確是急性冠脈綜合征病人心力衰竭發展和死亡率的獨立預測因子，與心臟病進展和嚴重程度有關[44]。雖然已建議將血清骨保護素和sRANKL水平作為各種心血管和代謝疾病血管風險和預后的生物標志物，但研究結果[44-45]不一致。骨保護素從血管內皮細胞持續釋放以響應炎性蛋白和細胞因子，表明骨保護素在血管損傷、炎癥和止血中起調節作用。因此，骨保護素可能作為早期內皮功能障礙的潛在生物標志物[46-47]，由血管損傷引起的骨保護素水平升高發揮內皮保護機制作用，可改善心血管疾病病人預后。但目前尚不明確骨保護素是否可調節或保護心血管代謝疾病，中醫藥領域相關研究較少，骨保護素作為預測心血管疾病風險的新型標志物有待于更多的中醫藥臨床及基礎研究加以證實。