諾如病毒檢測技術的研究進展

孫志強,黃志成,王 修,陳 健

(吉林省腫瘤醫院,吉林 長春130012)

諾如病毒(NV)，是人類杯狀病毒科中諾如病毒屬的一種病毒，是一組形態相似、抗原性略有不同的病毒顆粒。在全球均有因諾如病毒感染導致爆發性腹瀉的發生，且該病毒易感性強，傳播速度快，故尋找到合適方法進行諾如病毒的檢測也尤為重要。這也為臨床疾病診斷及實驗室檢查提供了依據。目前通過電鏡法、免疫學方法、分子生物學方法、都可以較好地實現對諾如病毒的檢測，這為后續諾如病毒感染性疾病的治療奠定了良好的基礎。在諾如病毒的檢測中，因反應特異性及靈敏度較高，可檢測出諾如病毒的不同分型，使諾如病毒疫苗及治療藥物的研發更加具有針對性，在臨床應用方面產生更高價值。因此，檢測諾如病毒對疾病的診斷治療及隨后控制傳染性疾病的爆發具有高度的指導意義。可見，諾如病毒的檢測在實驗室及臨床研究中都是十分必要的。

1 病毒結構特點

諾如病毒屬杯狀病毒科，諾如病毒屬，基因組長度約7.5-7.7 kb的單股正鏈RNA病毒，直徑約27-37 nm，無囊膜。其5＇端以共價鍵方式通過病毒末端結合蛋白結合，3＇端有多聚A尾[1]。諾如病毒共有3個開放閱讀框，ORF-1編碼非結構多聚蛋白，長約5 kb，ORF-2編碼主要結構蛋白 VP1，長約1.8 kb，ORF-3編碼強堿性微小結構蛋白，長約0.6 kb[2]。該病毒的衣殼蛋白為二十面體對稱結構，由180個分子折疊成 90個二聚體構成。衣殼蛋白分為突出區(P區)和外殼區(S區)，其中P區包含P1區和P2區，即拱干和拱頂。P2區因包含血型組織抗原結合序列和碳水化合物結合序列，故其屬于最可變區[3]。

2 發病機制

諾如病毒感染傳播途徑為糞-口傳播。其耐酸性較強，故能在人體上消化道定植并復制，其中信使RNA為病毒RNA[4]。諾如病毒受體是位于腸道黏膜表面的人類組織血型抗原。在感染時，人類組織血型抗原和諾如病毒衣殼蛋白VP1的突出區(P)的末端相結合。人類組織血型抗原中存在α-1,2糖基轉移酶(FUT2)的個體，更易感染諾如病毒。當人體不表達或缺失編碼轉移酶的基因時，機體則不感染諾如病毒[5]。

3 檢測技術

3.1 電鏡法

電鏡法為諾如病毒最早檢出的方法，因其靈敏度相對較低，同時要求較高的操作技術，故標本中病毒的檢測范圍須≥106才可檢出。因此，并不適用于臨床診斷[6]。

3.2 免疫學檢測

3.2.1ELISA法 檢測諾如病毒主要是通過抗原抗體反應[7]。固相上包被有諾如病毒特異性單(多)克隆抗體，標本中諾如病毒衣殼抗原被捕獲后，用標記的抗諾如病毒特異性多克隆抗體進行檢測。目前利用此技術的檢測試劑盒已被臨床廣泛應用[8]。Morillo SG等[9]將306例人體糞便標本用RIDASCREEN第三代諾如病毒ELISA檢測試劑盒進行檢測，結果顯示特異性為90.9%-96.4%，靈敏度為43.8%-97.1%。該方法檢測諾如病毒節約時間，節約成本，操作簡便。檢測下限約為105拷貝/ml。ELISA法可能會顯示假陰性或假陽性結果，這是由于各種抗原抗體種類及結構不同[10]。因諾如病毒該方法的檢測在特異性和靈敏度上仍有欠缺，同時病毒抗原易變異，故在檢測中被認定為篩查試驗，仍需進行以分子生物學檢測為主的確認試驗。

3.2.2免疫層析技術 該技術可用于快速檢測諾如病毒，結合了免疫親和作用及層析技術，其優點在于節約時間，操作方便，因此廣泛用于臨床檢測。免疫層析技術是利用試紙條，其上有利用諾如病毒抗原制備的單抗或多抗，來進行檢測[11]。Takanashia S等[12]利用該方法檢測諾如病毒。檢測試劑盒中為以重組樣病毒基因亞型GII-3或GII-4為抗原制備的多克隆抗體，標本中病毒復合物在測試線上，可捕獲抗體，并與抗體結合后反應。硝酸纖維薄膜上涂有測試線條。用蒸餾水按一定倍數稀釋樣品，制成10%稀釋液，并將等量稀釋液與等量緩沖液混合均勻。將試紙條放入檢測試劑盒內，混合物在毛細作用下沿條帶上升。15分鐘后，陽性為兩條區帶，陰性為一條區帶。因其節約成本等優點，多種免疫層析試劑盒已在國外廣泛應用。Pombubpa K等[13]利用免疫層析技術檢測急性胃腸炎患者糞便中的諾如病毒，此種試劑盒靈敏度可達83.3%，特異性為87.5%。在用于檢測諾如病毒的標本中，仍有12.5%的陰性樣品被誤檢為假陽性。因此，臨床上在檢測諾如病毒時，也常采用分子生物學方法進行檢測，并將其認定為諾如病毒檢測中的“金標準”。

3.3 分子生物學檢測

3.3.1常規RT-PCR 常規RT-PCR技術在臨床上應用廣泛，靈敏度較高，操作簡便，成本較低[14]。此技術是指隨核酸擴增，累積擴增產物，在檢測中或分析前，隨熱循環結束即達到平臺。利用該技術檢測諾如病毒時，可產生PCR產物，將產物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過不同的長度來鑒別不同的PCR產物[15]。該技術也可區分出諾如病毒不同的類型，通過病毒mRNA的逆轉錄，即mRNA→cDNA，隨后進行PCR擴增實現對目的基因的表達，使檢測靈敏度得以提升。同時，進行序列比對，提高試驗的特異性[16]。劉翼等[17]在RNA聚合酶基因區以Koopmans引物JV12Y/JV13I來應用RT-PCR技術進行諾如病毒檢測，RNA對該區具有依賴性。以358份腹瀉患兒糞便為檢測標本，對共42份諾如病毒陽性標本抽出11份進行測序，在DNA序列數據庫中比對分析，結果表明為諾如病毒。早期，RT-PCR技術會存在樣品污染的情況，這是由于擴增產物時需開放環境；同時，此技術在檢測諾如病毒時，變異率較高。后因型特異性引物的引進，情況得到大大改善。

3.3.2多重RT-PCR 多重RT-PCR，于相同反應體系，以同一DNA模板不同區段或不同模板進行擴增，同時需要不同的特異性引物。此法可檢測出諾如病毒的不同分型。該方法節約時間，節省成本，可同時實現多種病毒檢測，但靈敏度不高[18]。Khamrin P等[19]利用多重RT-PCR技術對10種病毒導致腹瀉的糞便標本進行檢測，設計PCR引物后得到不同長度的擴增產物片段，從而判斷不同種類的病毒。Shigemoto N等[20]對71例急性胃腸炎患者的糞便標本進行諾如病毒檢測，利用多重 RT-PCR 技術，以諾如病毒衣殼蛋白區及聚合酶區序列設計PCR引物。在確診了諾如病毒感染的61例標本中，其檢出率可達96.7%。Zhang等[21]對兩個公司研發的多重檢測技術平臺進行了調查，即BioFire公司和Luminex 公司。兩公司研究開發的薄膜陣列式胃腸檢測系統和胃腸道病菌檢測系統，均對諾如病毒的檢測有效，且檢測靈敏度有所提升。此類應用多重RT-PCR技術的檢測系統，可廣泛應用于在多種病原體之間諾如病毒的檢測。應用此類系統時，操作迅速，且樣品處理時間短[22]。多重RT-PCR技術的廣泛應用，對諾如病毒感染性疾病的檢測和臨床診斷都有重要的指導意義。

3.3.3熒光RT-PCR 熒光RT-PCR，即目標探針耦聯有熒光染料，用來檢測所生成的不同核酸，其中目標探針具有特異性。擴增產物在反應階段的任何PCR循環中均可產生，且具有較高的特異性和靈敏度[23]。諾如病毒中存在一靶向引物，可參與反應對諾如病毒基因型進行檢測，且反應靈敏，迅速。該引物位于基因區最保守的區域，即開放性讀碼框ORF1/2連接區[24，25]。雖然是在最保守區域，諾如病毒單核苷酸千變萬化，且無法估計，同時，根據此區域設計的探針和引物在檢測諾如病毒的突變株時是否具有相同的反應靈敏性，這也無法保證[26]。故在不同的檢測過程中，應適當調整探針和引物。Miura T等[27]應用熒光RT-PCR技術，對幾組糞便標本中3種不同的諾如病毒同時進行檢測。反應階段設計3對不同的引物，在熒光染色過程中，應用相同熒光染料，可以使反應的特異性和靈敏度大大增強。這是由于此方法可疊加3種基因組不同諾如病毒的熒光信號。與其他RT-PCR技術的檢測結果相同，糞便標本中可檢測出諾如病毒。現已根據此技術研發出多種檢測試劑盒，如德國RIDAGENE試劑盒，其可檢測出多種不同分型的諾如病毒[28]。現已進行的諾如病毒GIV型熒光RT-PCR檢測，在全世界臨床檢測診斷及實驗室研究中已大規模應用[29,30]。

4 小結

在諾如病毒的檢測中，電鏡法因靈敏度較低，操作要求較高，而不被廣泛使用。免疫學方法操作簡便，并且可節約時間，可進行諾如病毒的初步篩查及快速檢測，但其靈敏度及特異性仍欠佳。分子生物學法被認定為諾如病毒檢測的“金標準”，具有良好的特異性及靈敏度，檢測結果也較為準確，但技術水平要求相對嚴格。為了更準確地檢測諾如病毒，目前實驗室研究中嘗試利用基因芯片，基因探測等方法進行諾如病毒的檢測。同時，可應用互聯網系統，不同實驗人員檢測不同標本不同分型的諾如病毒時，可將特異性較強的檢測結果輸入到系統中，建立諾如病毒數據庫，增加樣本的多樣性，供研究人員進行比對分析，從而研制出新的諾如病毒疫苗。但是，目前研究還面臨著一定的問題，例如人體感染諾如病毒后，是否在病毒迅速繁殖的過程中，機體出現了強耐藥性或是否免疫力發生了改變等。因此，諾如病毒的檢測技術仍然存在不足。最重要及最有效的方式仍是采取一定行動，加強對諾如病毒的預防，并減少諾如病毒的傳播。