GPC3在肝細(xì)胞癌發(fā)生中的作用機(jī)制研究進(jìn)展

葉嬋琦 李瓊 單建貞 阮健

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，以亞洲和非洲高發(fā)。近年來西方發(fā)達(dá)國家的HCC發(fā)病率也呈上升趨勢，尤其是美國和加拿大[1]。我國是世界上HCC高發(fā)地區(qū)之一，每年發(fā)病人數(shù)約為30萬，年病死率為20.40/10萬，其中城市為19.98/10萬，農(nóng)村為23.59/10萬，分別居惡性腫瘤病死率的第二位和第一位[2]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican3，GPC3）是一種細(xì)胞表面蛋白多糖，含有與核心蛋白相連的硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）鏈。GPC3在70%的HCC中高表達(dá)，但在正常成人組織中不表達(dá)，與HCC患者的預(yù)后不良相關(guān)[3-4]。Wnt信號在胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中至關(guān)重要。在成人中，Wnt信號通路可以促進(jìn)組織更新和再生，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。多項研究表明GPC3的表達(dá)通過Wnt信號通路調(diào)控腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[6]。

由于GPC3在Wnt及YAP和Hh等多種信號級聯(lián)反應(yīng)中的重要性，GPC3可能作為生物標(biāo)志物和免疫治療中的有效治療靶點在HCC的治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7-8]，因此我們對GPC3在HCC中的作用機(jī)制及相關(guān)進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。

1 GPC3的結(jié)構(gòu)及功能

GPC屬于肝素硫酸蛋白多糖家族，由一個核心蛋白和兩條HS糖胺聚糖鏈組成，通過糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定駐留在細(xì)胞膜外，是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用的主要部分[9]。GPC的大小在60～70 kDa，其N端有分泌信號肽，C端為GPI錨。所有的GPC都存在14個保守的半胱氨酸區(qū)域，可以形成二硫鍵連接N端和C端。這種獨特結(jié)構(gòu)使其具有儲存和隔離細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子等分子的能力[7]。GPC吸引這些分子，并在細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞膜周圍形成濃度梯度，允許識別不同閾值的受體。哺乳動物中，該家族包含GPC1～6共6個亞型。GPC3的HS鏈已被證明可以結(jié)合包括Wnt在內(nèi)的分子，也有相關(guān)研究表明核心蛋白也可能參與結(jié)合Wnt作為一個共受體[10-12]。有研究在GPC3的N端發(fā)現(xiàn)了一個用于結(jié)合Wnt的富含半胱氨酸的區(qū)域，這為GPC3是一個調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞中Wnt/βcatenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Wnt共受體提供了證據(jù)[13]。GPC3通過HS鏈吸引和儲存生長因子，并將Wnt識別為共受體，在HCC細(xì)胞中發(fā)揮細(xì)胞表面糖蛋白的作用，調(diào)節(jié)Wnt信號通路。

2 GPC3與信號通路

2.1 通過GPC3調(diào)節(jié)Wnt信號 Wnt通路在某些疾病中異常激活，包括腫瘤和代謝紊亂。經(jīng)典的Wnt信號通路傳遞是一個β-catenin依賴的過程，由Wnt通過兩個共受體結(jié)合產(chǎn)生，即G蛋白偶聯(lián)受體Frizzled（FZD）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）[14]。Wnt配體與 FZD 中含有Wnt結(jié)合域的胞外富含胱氨酸結(jié)構(gòu)域結(jié)合，兩者的相互作用促進(jìn)FZD-LRP5/6受體復(fù)合物的形成[15]。FZD和LRP5/6構(gòu)象的改變以及隨后糖原合酶激酶3和酪蛋白激酶1的磷酸化促進(jìn)軸蛋白（Axin）的招募，細(xì)胞質(zhì)散亂蛋白（dishevelled，DVL）被招募并結(jié)合到FZD的C端尾部進(jìn)而形成含有DVL、Axin和其他結(jié)合物的破壞復(fù)合體[16-18]。Axin抑制了β-catenin降解，從而使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并向細(xì)胞核移動，驅(qū)使細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[19]。由于Wnt信號對細(xì)胞分化和修復(fù)等多種功能至關(guān)重要，因此Wnt信號通路的異常可導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生。

GPC3能在HCC中激活經(jīng)典的Wnt信號通路，約95%的HCC存在Wnt/β-catenin異常[20]。在HCC細(xì)胞系中，GPC3過表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長，說明GPC3作為Wnt蛋白的共受體可以調(diào)節(jié)細(xì)胞表面信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。GPC3和缺失HS鏈的突變體GPC3都能與Wnt形成復(fù)合物，表明該復(fù)合物是通過GPC3核心蛋白激活的。Wnt激活不需要HS鏈，而HS鏈可能對穩(wěn)定FZD很重要[21]，這為GPC3和Wnt相互作用提供了初步的證據(jù)。有研究報道通過抗體阻斷GPC3可以增強(qiáng)Hep3B等HCC細(xì)胞系Wnt3a/β-catenin信號活性。Gao等[6]分離出HS20抗體，通過結(jié)合HS鏈阻斷Wnt3a/β-catenin信號通路，發(fā)現(xiàn)HS20抗體干擾GPC3與Wnt3a的結(jié)合，阻礙與FZD的結(jié)合，在HCC細(xì)胞系和內(nèi)源性表達(dá)GPC3的細(xì)胞中抑制了Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。該研究還指出，HS20在分別接種Hep3B和HepG2細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)模型中具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[6]。另一項研究在Hep3B模型中證實了GPC3和Wnt的內(nèi)源性相互作用[22]。致癌的人硫酸酯酶 2（sulfatase 2，SULF2）在60%以上的HCC患者中上調(diào)，并在哺乳動物細(xì)胞中具有6-O-脫硫酶活性，可以從HS鏈中釋放Wnt，并與GPC3和Wnt形成復(fù)合物。此外，研究表明，HS的硫酸化可能在結(jié)合Wnt和其他生長因子方面發(fā)揮重要作用。為了了解Wnt在HS聚糖上結(jié)合基序的確切機(jī)制，Gao等[11]設(shè)計了一系列不同長度和硫酸化修飾的合成HS寡糖，研究發(fā)現(xiàn)，2-O和6-O硫酸化對Wnt結(jié)合至關(guān)重要，而3-O硫酸化可以增強(qiáng)Wnt結(jié)合，這為GPC3 HS鏈上的Wnt結(jié)合域提供了直接證據(jù)。上述實驗數(shù)據(jù)合理地聯(lián)系了GPC3、SULF2、Wnt和 FZD。然而，HS上精確的Wnt結(jié)合域在結(jié)構(gòu)和功能上還有待研究證實。

通過使用HN3單結(jié)構(gòu)域抗體，可以發(fā)現(xiàn)GPC3核心蛋白上有 Wnt結(jié)合結(jié)構(gòu)域[12，23]。Gao 等[13]對 Wnt/GPC3進(jìn)行建模，將位于GPC3的N端疏水槽內(nèi)的關(guān)鍵殘基苯丙氨酸41（F41）突變?yōu)镕41E，發(fā)現(xiàn)其在HCC細(xì)胞和小鼠模型中對Wnt3a的識別具有重要作用。同時發(fā)現(xiàn)GPC3的核心蛋白和HS多糖鏈的兩個主要部分都可以調(diào)節(jié)Wnt信號。在Wnt基因檢測功能報告中，單獨的GPC3過表達(dá)激活了Wnt信號，并可通過F41E突變而減弱，但不能通過消除HS鏈而減弱。有趣的是，GPC3和FZD共轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)了Wnt活性的協(xié)同激活。當(dāng)GPC3的HS鏈被移除后，這種協(xié)同效應(yīng)被終止，而F41E突變則不再有協(xié)同效應(yīng)。該動態(tài)模型可以將GPC3表達(dá)與HCC疾病進(jìn)展聯(lián)系起來，低FZD和無GPC3代表正常肝臟，高GPC3和低FZD代表早期HCC，高FZD和高GPC3代表晚期HCC[24]。正常肝細(xì)胞中不存在GPC3，Wnt可在無GPC3協(xié)同的情況下獨立激活FZD,保持Wnt/β-catenin的普通激活水平。在HCC中GPC3上調(diào)，GPC3作為Wnt共受體，通過位于GPC3 N端包含F(xiàn)41的富含半胱氨酸疏水槽吸引Wnt至細(xì)胞表面[25]。HCC細(xì)胞中GPC3含量進(jìn)一步升高時，F(xiàn)ZD富集形成Wnt/GPC3/FZD復(fù)合物，此時HS發(fā)揮穩(wěn)定Wnt和FZD的橋梁作用，Wnt信號通路擴(kuò)大激活。。

2.2 GPC3和Wnt參與YAP信號調(diào)控 早期在果蠅模型中的研究涉及Hippo信號通路，其在調(diào)節(jié)器官大小和發(fā)育中起著重要作用。在哺乳動物中，Hippo信號通路涉及兩個主要激酶，正蛋白激酶1/2（mammalian sterile20-like kinase1/2，Mst1/2）和大腫瘤抑制基因（large tumor suppressor 1/2，Lats1/2）激酶，Lats1/2 使轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP發(fā)生磷酸化而失活，失活的YAP下調(diào)其下游靶基因如Cyclin E、diap1和bantam等的表達(dá)。YAP已被證明是Hippo信號通路中起關(guān)鍵作用的核效應(yīng)因子，而Hippo信號通路在哺乳動物中導(dǎo)致YAP失活的確切機(jī)制尚不清楚[26]。此外，在信號通路方面的最新進(jìn)展表明，Hippo通路能夠抑制肝臟過度生長和HCC的發(fā)展。YAP在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、組織再生和腫瘤形成中起著至關(guān)重要的作用。研究表明GPC3和Wnt通過YAP建立了聯(lián)系，但β-catenin和YAP的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未明確。此外，在細(xì)胞質(zhì)中，有證據(jù)表明YAP可以調(diào)節(jié)DVL[27]。在HCC組織中，YAP的表達(dá)較高，提示HCC進(jìn)展與YAP表達(dá)呈正相關(guān)[28]。

Miao等[29]利用靶向GPC3的抗體發(fā)現(xiàn)HN3能有效抑制HCC細(xì)胞生長。在進(jìn)一步探索HN3具體作用機(jī)制時，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)HN3處理的HCC細(xì)胞中磷酸化的YAP（p-YAP），即失活的YAP表達(dá)明顯升高。此外，在接受HN3處理的HCC細(xì)胞中，YAP總水平是降低的。GPC3沉默導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖速度下降，重組YAP的重新導(dǎo)入能夠阻止由于GPC3沉默引起的細(xì)胞凋亡。該結(jié)果與早期發(fā)現(xiàn)的GPC3在HCC細(xì)胞中調(diào)控YAP信號通路一致[23]。在HCC細(xì)胞中敲低YAP，腫瘤細(xì)胞增殖速度顯著減慢。在隨后的實驗中，通過HN3-GPC3的結(jié)合阻斷Wnt信號通路的同時也抑制了YAP的表達(dá)，提示W(wǎng)nt可能參與了YAP信號的上游調(diào)控[12]。以上結(jié)果表明YAP參與調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的增殖，且GPC3可能是YAP的上游調(diào)控因子，這些工作將YAP與GPC3和Wnt合理地聯(lián)系起來。

2.3 GPC3調(diào)節(jié)Hh信號 Hh信號通路在胚胎發(fā)育中起著決定性作用，參與細(xì)胞生長、分化和血管形成等。當(dāng)Hh通路過度激活時，可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生或轉(zhuǎn)移，與多種腫瘤密切相關(guān)[30-31]。在探討GPC3在HCC細(xì)胞中的生物學(xué)作用時，Wang等[32]發(fā)現(xiàn)GPC3通過Hh信號通路促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖。在哺乳動物中有3種Hh配體，包括desert（Dhh），indian（Ihh）和sonic（Shh）。Hh信號傳遞受靶細(xì)胞膜上兩種受體的控制，分別為12次跨膜蛋白 patched（Ptc）和 7 次跨膜蛋白 smoothened（Smo）。在正常情況下，Ptc抑制Smo蛋白活性，從而抑制下游通路，這時下游的膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白（Gli）在蛋白酶體內(nèi)被截斷，并以羧基端被截斷的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Ptc和Hh結(jié)合以后，解除對Smo的抑制作用，促使 Gli蛋白與蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）及一些未知因子與微管形成大分子復(fù)合物，使得全長Gli蛋白進(jìn)入核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。GPC3在細(xì)胞膜上能與Ptc競爭性結(jié)合Hh，當(dāng)GPC3與Hh結(jié)合后能促發(fā)胞吞作用及復(fù)合物的降解。此外，GPC3與Hh結(jié)合后導(dǎo)致未結(jié)合的Ptc受體數(shù)目增加，從而加強(qiáng)了對Smo的抑制作用。因此，GPC3在Hh通路是起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用的[14，33]。

總而言之，上述信號通路之間的確切聯(lián)系尚不清楚，Wnt、YAP和 Hh通路的關(guān)鍵步驟可能通過GPC3進(jìn)行連接，未來對GPC3的進(jìn)一步研究將有助于加深對HCC發(fā)病機(jī)制的理解及推動新型抗腫瘤藥物的研發(fā)。