E-Cadherin/β-Catenin 與PTEN-PI3K/Akt在卵巢漿液性腫瘤中的表達及其意義

陳勝民 王國平 林志仁 袁峰

卵巢漿液性腫瘤（ovarian serous tumor，OST）是一類異質性腫瘤，不同級別卵巢腫瘤生物學行為有顯著差異，預后明顯不同，同時由于缺乏早期診斷手段，復發率和病死率高[1]。卵巢漿液性交界性腫瘤（ovarian serous borderline tumor，OSBT）又稱卵巢低度惡性潛能（low malignant potential，LMP）上皮性腫瘤，約占卵巢上皮性腫瘤的15%～20%，OSBT的生物學行為介于良性與惡性腫瘤之間。相較于卵巢漿液性癌（ovarian serous carcinoma，OSC），OSBT 多發生于育齡女性，多見于 25～55歲，一般期別較早，病程進展慢，預后好，約占卵巢交界性腫瘤的65%，其他病理類型較少見[2]。研究證實，當β-連環蛋白（Beta-catenin，β-Catenin）的酪氨酸磷酸化時，上皮型-鈣粘蛋白（epithelial calcium-dependent cell adhesion proteins，E-Cadherin）/β-Catenin 復合體解聚，ECadherin表達下調，導致細胞間粘附力降低，促使腫瘤原發灶侵襲轉移[3]。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因（phosphatase and tension homologdeleted on chromosome ten，PTEN）缺失和或磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）激活可使其下游分子，絲氨酸蛋白激酶B473（protein kinase B，PKB/AktSer473）磷酸化導致Akt活化，激活或抑制其下游靶蛋白，導致癌變進展，而PTEN的過表達則可抑制細胞增殖遷移[4]。目前雖然有文獻報道了上述部分蛋白在OSC中的表達情況，但未見上述全部蛋白表達在OST中的表達差異以及相互之間關系的報道。為此本研究應用免疫組化法，檢測 OST 中 E-Cadherin、PTEN、PI3Kp110α、p-AktSer473、β-Catenin以及Ki-67蛋白的表達并分析其相互關系，探討OST的發生發展機制，為OST的臨床診治以及預后判斷提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集本院病理科2002年1月至2017年11月石蠟包埋組織標本共100例，其中正常卵巢組織（normal ovarian tissue，NOT）10 例、卵巢漿液性囊腺瘤（ovarian serous cystadenoma，OSA）12 例、OSBT18例、OSC60例，各種標本組織切片均已由病理學專家進行診斷和分類。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人E-Cadherin、β-Catenin、PTEN以及Ki-67單抗（抗體批號：TA800670、ZM-0442、ZM-0116、TA500265）和S-P試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗人PI3Kp110α和p-AktSer473單抗（抗體批號：4249T、4060T）購于美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測 采用免疫組化SP三步法檢測ECadherin、β-Catenin、PTEN、PI3Kp110α、p-AktSer473以及Ki-67表達，用已知陽性組織作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照，具體實驗步驟均按試劑說明書進行操作。

1.2.2 結果判斷 E-Cadherin陽性表達部位是細胞膜和（或）細胞質，β-Catenin陽性表達部位是細胞膜或細胞核，PTEN、PI3Kp110α和p-AktSer473陽性表達與細胞質和（或）細胞核，Ki-67陽性表達部位是細胞核。鏡下隨機觀察10個視野，避開切片周邊，每個視野計數100個腫瘤細胞，共計1 000個細胞，陽性細胞數占總細胞數的百分比為陽性細胞比例，取其平均值。對腫瘤細胞的 E-Cadherin、β-Catenin、PTEN、PI3Kp110α、p-AktSer473表達進行評價時，陽性細胞占比計分如下：陽性細胞占比＜5%計 0分，6%～25%計 1分，26%～50%計 2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分；另外根據細胞染色強度計分，細胞定位部位無顯色計0分，淺棕黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。根據陽性細胞占比和著色強度來綜合判斷，最終結果由兩項記分相乘所得，0～1 分為-，2～4 分為+，5～8 分為++，9～12 分為3+++。其中-為陰性，+～+++為陽性[5]。Ki-67 的表達采用陽性細胞率。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計數資料組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組 E-Cadherin、PTEN、PI3Kp110α、p-AktSer473、β-Catenin以及Ki-67表達比較 各組間總體比較，OSC組E-Cadherin、PTEN陰性細胞率均高于OSBT、OSA和NOT組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；PI3Kp110α、p-AktSer473、β-Catenin以及Ki-67陽性細胞率高于OSBT、OSA和NOT組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。見表 1，圖 1-4（插頁）。

圖1 PI3Kp110α在OSC中的表達（SP染色，×200）

圖2 p-AktSer473在OSC中的表達（SP染色，×200）

圖3 β-Catenin在OSC中的表達（SP染色，×200）

圖4 Ki-67在OSC中的表達（SP染色，×200）

2.2 不同臨床特征OSC中E-Cadherin、PTEN、PI3Kp110α、β-Catenin以及Ki-67表達比較 浸潤與非浸潤的OSC標本比較，E-Cadherin陰性細胞率的差異有統計學意義（P＜0.05），PTEN陰性細胞率的差異有統計學意義（P＜0.01）；有無淋巴結轉移的OSC標本比較，E-Cadherin、PTEN陰性細胞率的差異也有統計學意義（P＜0.05）；有無浸潤與浸潤、有淋巴結轉移與無淋巴結轉移的OSC間分別比較，PI3Kp110α、p-AktSer473、β-Catenin 以及Ki-67陽性細胞率的差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

3 討論

3.1 E-Cadherin/β-Catenin在OST發生發展中的作用 正常情況下，E-Cadherin和β-Catenin構成復合體，錨定于肌動蛋白細胞骨架上，使相鄰細胞形成穩定連接[3，6]。在異常因素觸發下，β-Catenin的酪氨酸發生磷酸化，E-Cadherin/β-Catenin 復合體解聚，E-Cadherin 表達下調，導致細胞間的粘附力降低，細胞發生分散，從而出現向外周侵襲性生長的現象，最終腫瘤脫離原發灶發生轉移[3，7]。本研究顯示，E-Cadherin蛋白表達缺失在不同類型的OST之間存在差異，E-Cadherin蛋白表達缺失率在OSC中最高，其次是OSBT、OSA，最低的是NOT，表明E-Cadherin表達缺失可能與OST發生發展有關。本研究還顯示，β-Catenin陽性表達率在不同類型的OST之間也存在差異，β-Catenin蛋白陽性表達率在OSC中最高，其次是OSBT、OSA，最低的是NOT，表明β-Catenin蛋白過表達也可能與OST發生發展相關。本研究表明OST的發生發展，伴隨著惡性程度增高的過程，與OST中E-Cadherin功能缺失，伴隨β-Catenin過表達逐級增高，可能具有同步一致性。

3.2 PTEN-PI3K/Akt信號通路參與OST的發生發展 研究發現，PTEN通過其脂質磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3），阻斷 PI3K/AKT信號傳導，從而實現其抑癌作用，將此稱為PTENPI3K/Akt信號轉導通路[8-10]。目前認為，與卵巢癌密切相關的是ⅠA型PI3K，其是由p85調節亞基和p110催化亞基組成的異二聚體。PKB/Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K信號傳導通路中的下游靶激酶。正常情況下，PTEN負調節PI3K，但在細胞外因子異常刺激下Ras和p110α直接結合導致PI3K活化。PTEN缺失或PI3K激活均可使其下游分子Akt的Ser473發生磷酸化導致Akt活化，從而激活或抑制其下游靶蛋白，使OST發生進展，而PTEN的過表達則可抑制細胞增殖遷移[11-14]。本研究顯示，PTEN蛋白表達缺失率在不同類型的OST之間存在差異，PTEN蛋白表達缺失率在OSC中最高，其次是OSBT、OSA，最低的是NOT，表明PTEN蛋白表達缺失參與OST的發生進展。本研究還顯示，PI3Kp110α、p-AktSer473以及Ki-67蛋白陽性表達率在OSC中最高，其次是OSBT、OSA，最低的是NOT，提示PI3K/Akt過表達與OST的發生發展相關。因此推測PTEN功能的缺失與PI3Kp110α、p-AktSer473蛋白的激活在OST的發生發展可能存在協同作用。本研究表明，在OST的發生發展中存在PTEN功能缺失，伴隨PI3Kp110α、p-AktSer473以及Ki-67過表達，提示 PTEN和PI3K/Akt共同參與OST的發生、發展。

表1 各組 E-Cadherin、PTEN、PI3Kp110α、β-Catenin以及 Ki-67表達比較[例（%）]

表2 不同臨床特征OSC中各種蛋白表達比較[例（%）]

3.3 E-Cadherin/β-Catenin 與 PTEN-PI3K/Akt共同參與OST的發生發展 有研究顯示在OSC中，E-cadherin可減少β-Catenin在細胞核中的積累，誘導PTEN表達，抑制PI3K/AKT信號轉導，從而抑制細胞生長[14-15]。在OST癌變過程中，E-cadherin缺失，細胞核中β-Catenin發生積累，導致β-Catenin反式激活，從而抑制PTEN水平，激活PI3K/AKT信號通路，通過抑制糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase-3，GSK3β）進一步穩定β-Catenin信號，促進OST的發生發展[14-17]，見圖5。本研究顯示，E-Cadherin、PTEN蛋白表達缺失在不同類型的OST之間存在差異，在OSC中最高，其次是OSBT、OSA，最低的是 NO。PI3Kp110α、p-AktSer473以及β-Catenin蛋白陽性表達率在OSC中最高，其次是OSBT、OSA，最低的是NOT。本研究發現，在OST的發生發展中，E-Cadherin、PTEN蛋白表達缺失，而PI3Kp110α、p-AktSer473以及β-Catenin過表達，同時發現Akt活化時Ki-67蛋白表達，即增殖活性呈顯著相關，提示Akt活化后可能通過Wnt信號通路阻斷GSK3β活性，導致過度增殖癌變進展。

圖5 E-Cadherin/β-Catenin通過PTEN-PI3K/Akt調控 OST癌變進展

目前為止，關于OST病因及發生機制尚不清楚，為降低OST的發病率，提高生存期以及生活質量，其發病機制的研究是目前的重中之重。不同階段卵巢腫瘤生物學行為有顯著差異，預后明顯不同，由于缺乏早期診斷手段，復發率和病死率高，預后差。本研究發現E-Cadherin/β-Catenin與PTEN-PI3K/Akt信號通路共同參與OST的發生發展，本研究從蛋白質表達角度比較了不同類型的OST之間各蛋白表達差異，探討各自的功能和相互關系，不僅有助于揭示OST的病因以及發病機制，而且為不同階段OST的早期診斷，開發新的抗癌藥物和尋求新的基因治療以及預后判斷提供了新的思路。