褪黑素通過Akt抑制胰島素抵抗HepG2細胞糖內生

盧世姝，蔣文艷，佘美華， 楊 娟，張 瑤，尹衛東

(1.南華大學衡陽醫學院，湖南 衡陽 421001；2.邵陽學院附屬第二醫院，湖南 邵陽 422000)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)的主要特征和前期表現，是多種原因所導致的組織或靶細胞對胰島素的敏感性和/或反應性降低，表現為外周組織尤其是肝臟、肌肉、脂肪組織等對葡萄糖的攝取和利用障礙。作為胰島素信號通路中的重要信號分子，Akt(PKB)一方面使糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)-3β磷酸化(如Ser9)而失活，導致下游的糖原合酶(glycogen synthase，GS)活化，促進糖原的合成[1]；同時Akt使叉頭框轉錄因子O1(forkhead box-O1，FoxO1)磷酸化并從細胞核轉移至胞質，失去其激活糖異生相關酶基因轉錄的活性，結果抑制糖異生[2]。研究表明褪黑素(melatonin，MLT)與機體葡萄糖穩態的維持有關[3]，如隨著年齡的增長褪黑素水平降低，而IR和T2D則呈上升趨勢。基于此，本實驗誘導建立HepG2 IR細胞模型，以此研究MLT對胰島素抵抗細胞葡萄糖代謝的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料HepG2細胞株購自中科院上海細胞所；MLT由Neurim Pharmaceuticals公司提供；胎牛血清(FBS)、胰島素、DAPI等為Sigma公司產品，兔抗人p-Akt(Ser473)(貨號：4060s)、p-GSK(Ser9)(9323P)、FoxO1(2880p)及p-FoxO1(Ser256)(9461P)一抗均為CST產品，辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗(sc-2012)購于北京博奧森公司。酶標儀(Millipore 公司)，熒光倒置顯微鏡(Nikon公司)，凝膠成像系統(Tanon公司)。

1.2 細胞培養與處理HepG2細胞采用L-DMEM (10% FBS)培養液、37℃、5% CO2飽和濕度下培養。待細胞生長到培養瓶底80%左右時進行傳代，轉入6孔板，并分為對照組 (control)和IR模型組(IR)，分別以含葡萄糖(5.5 mmol·L-1)或高糖(25 mmol·L-1)高胰島素(1 μmol·L-1)的DMEM培養24 h；IR組再用含MLT(10 nmol·L-1)或生理鹽水的DMEM培養液培養6 h。

1.3 葡萄糖消耗為檢測細胞在基礎狀態和胰島素刺激下的葡萄糖攝取，各組分別換為含胰島素(0或100 nmol·L-1)的無血清低糖DMEM培養基培養6 h，各自以未接種細胞的空白孔作對照，葡萄糖氧化酶法檢測培養液中葡萄糖含量，計算各組細胞的葡萄糖消耗量。

1.4 糖原含量測定PBS洗滌后用胰酶消化并離心收集各組細胞，按糖原檢測試劑盒說明加入堿液300 μL以破壞其他成分而保留糖原，雙蒸水定容，加入顯色液，沸水浴5 min，冷卻后于620 nm波長下測OD值，計算出糖原含量。

1.5 Western blot分析冷PBS漂洗3次后裂解細胞，常規方法提取總蛋白，BCA法定量，沸水中煮5 min后上樣電泳分離，轉膜，脫脂奶粉室溫下封閉2 h，p-Akt、p-GSK、FoxO1、p-FoxO1一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育2 h，顯影。

1.6 細胞免疫熒光分析將蓋玻片置于6孔板，使細胞爬片培養并分組處理，4%多聚甲醛固定，通透10 min(Triton-X100)，1% BSA封閉30 min，FoxO1一抗(1 ∶100)4℃過夜，FITC標記二抗 (1 ∶100)室溫孵育40 min，DAPI避光染核5 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 MLT促進IR HepG2細胞葡萄糖的攝入各組細胞葡萄糖的基礎攝入(無胰島素作用)或消耗量無顯著差異。胰島素刺激后，對照組葡萄糖消耗量增加了78%(P<0.01)；IR組細胞糖消耗量雖也有增加，但明顯低于對照組P<0.01，而胰島素抵抗組經MLT處理后，葡萄糖消耗量較IR組有明顯提高(P<0.01，Fig 1)。

2.2 MLT對IR HepG2細胞糖原含量的影響Fig 2顯示：IR組細胞糖原含量僅為對照組細胞的14%(P<0.01)，但經MLT處理后其糖原含量明顯增加，約為IR組細胞的3倍以上(P<0.01)。提示MLT能提高胰島素抵抗狀態下細胞的糖原合成。

2.3 MLT對Akt和GSK-3β磷酸化水平的影響蛋白分析顯示：與對照組相比，IR組細胞p-Akt和p-GSK-3β蛋白水平明顯降低(P<0.01)，分別降低了約23%和30%；而該胰島素抵抗模型細胞經MLT處理后，其p-Akt和p-GSK-3蛋白水平分別增加48%和66%(P<0.01) (Fig 3)。

Fig 1 Reversing of glucose consumption by melatonin in IR HepG2

Fig 2 Effects of melatonin on glycogen synthesis

Fig 3 Effects of melatonin on levels of p-Akt and p-GSK-3β in insulin resistant HepG2

2.4 MLT對FoxO1蛋白表達和轉位的影響蛋白分析顯示(Fig 4)：與對照組相比，IR組細胞p-FoxO1蛋白降低近48%，差異明顯(P<0.01)；經過MLT處理后，p-FoxO1蛋白水平與IR組細胞相比上調約42%(P<0.01)。免疫熒光監測則顯示胰島素刺激后，對照組和MLT處理IR細胞胞質中FoxO1蛋白較多，而IR組細胞質FoxO1蛋白則基本無表達(Fig 5)。

Fig 4 Up-regulation of p-FoxO1 by melatonin in insulin

Fig 5 Level of FoxO1 in cytoplasm in HepG2 cells(40×)

3 討論

肝臟作為胰島素的重要靶器官，參與了胰島素對糖、脂、蛋白質的代謝調節，因此肝臟對胰島素不敏感是IR的重要體現之一。肝細胞以糖原形式對葡萄糖進行儲存，同時又通過糖異生作用和糖原分解以補充血糖，即產生內源性葡萄糖。抑制肝細胞葡萄糖的內生是胰島素調節機體葡萄糖穩態的途徑之一，肝胰島素抵抗時，胰島素的此抑制作用減弱，以致高分泌量的胰島素亦無法代償，最終導致機體糖代謝紊亂[4-6]。本研究中采用高糖高胰島素培養的HepG2細胞對胰島素介導的糖攝取減少、糖原合成降低(P<0.01)，說明該細胞對糖的利用能力減弱，提示細胞發生胰島素抵抗。但研究結果顯示褪黑素逆轉了高糖高胰島素的這一作用，提示褪黑素對高糖高胰島素等胰島素抵抗高危誘導因素下的肝細胞具有保護作用。

Akt是胰島素信號通路中的一個重要分子，Akt的活化直接參與了肝臟糖原合成與分解以及糖異生的過程。一方面Akt通過Akt/GSK-3β信號通路調節糖原合成并維持葡萄糖穩態[7]。GSK-3β是一種富含有絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Try)的激酶，胰島素通過PI3K通路可使Akt磷酸化而激活，進而使下游靶蛋白GSK-3β 磷酸化而喪失激酶活性，導致糖原合成關鍵酶GS去磷酸化活化并刺激糖原的合成[1]，從而維持機體葡萄糖穩態。本研究發現，經褪黑素處理的IR HepG2細胞p-Akt和p-GSK-3β(Ser9)磷酸化水平明顯升高，提示褪黑素可能通過Akt蛋白誘導GSK-3β的磷酸化，進而促進了肝細胞葡萄糖的攝取利用和糖原的合成。

FoxO1是Akt的又一靶蛋白，FoxO1蛋白為Fox轉錄因子O亞家族成員，是細胞內能量代謝的重要調節因子，同時也是胰島素信號通路中的關鍵分子。FoxO1有多個磷酸化位點(如Ser256)，胰島素經PI3K/Akt通路使之磷酸化。磷酸化的FoxO1從細胞核外排至胞質，與受調節基因啟動子的解離使其失去轉錄因子的活性。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6pase)是糖異生的兩個關鍵酶，其表達即受FoxO1轉錄激活[2,8-9 ]，因此通過PI3K/Akt/FoxO1下調它們的表達是胰島素抑制糖異生的關鍵。IR時因PI3K/Akt通路抑制而降低對FoxO1磷酸化的作用，使得糖異生增強，血糖升高。本研究發現MLT可以促進FoxO1蛋白的磷酸化以及FoxO1蛋白從核轉出至胞質，同時磷酸化的Akt水平增高，說明MLT可能通過激活Akt/FoxO1信號通路對肝臟糖異生起到抑制作用，從而減少內源性葡萄糖的產生。

綜上所述，我們認為褪黑素一方面通過Akt/GSK-3β途徑促進肝細胞對葡萄糖的攝取和糖原合成，同時又通過Akt/FoxO1通路抑制肝糖異生，從而改善胰島素抵抗和參與葡萄糖穩態的調節。

(本文實驗在南華大學醫學院完成，所有作者均參與實驗設計與實施、數據分析以及論文撰寫工作。)