SIRT3介導褪黑激素保護帕金森病多巴胺能神經元的作用機制

蔣德旗，徐蘭程，毛書慧，趙仕花

(1. 玉林師范學院生物與制藥學院，2. 廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室，廣西 玉林 537000)

中腦黑質多巴胺能神經元丟失為帕金森病(Parkinson’s disease，PD)主要病理特征。PD多巴胺能神經元死亡與膠質細胞活化、氧化應激、炎癥損傷等因素關系密切。褪黑激素可通過抗氧化、抗細胞凋亡、清除自由基、抑制炎癥因子表達及抗神經毒性，發揮神經保護作用[1-2]。研究發現，褪黑激素能夠抑制6-羥基多巴所致PD大鼠模型黑質星形膠質細胞的增殖和活化，并使黑質紋狀體部位酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性多巴胺能神經元數量增多，發揮PD保護作用[3]。褪黑激素可改善PD動物模型的行為學功能，減少多巴胺能神經元死亡，延緩PD發展[4]，但相關分子機制還不明確。Sirtuin 3(SIRT3)屬于線粒體蛋白，具有調節氧化應激、能量代謝、保護線粒體功能等作用，在PD等神經疾病中發揮一定保護作用[5-6]。多項研究表明[7-8]，褪黑激素可上調SIRT3發揮抗氧化、抑制炎癥損傷。但SIRT3是否介導褪黑激素對PD多巴胺能神經元的保護作用，還不清楚。本研究探討了褪黑激素保護PD多巴胺能神經元的作用機制是否與SIRT3功能相關，以進一步了解褪黑激素的神經保護作用分子機制，為PD治療藥物研制提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物C57BL/6小鼠，8～10周齡，♂，體質量約20 g，購自廣西醫科大學動物實驗中心，動物生產許可證號為SCXK(桂)2014-0002。適用性飼養3 d后，開展相關試驗。

1.2 試劑1-甲基,4-苯基,1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)(M0896)、褪黑激素(M5250)購自美國Sigma公司；SIRT3(ab86671)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)(ab13533)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)(ab15323)抗體購自英國Abcam公司；TH(sc73152)、離子鈣結合蛋白1(ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1) (sc32725)抗體購自美國Santa Cruz公司；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)(AF0006)抗體和相關二抗購自碧云天生物技術公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度檢測試劑盒、預染蛋白Marker購自美國Thermo Fisher公司；氧化應激與炎癥因子測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；TRIzol購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、DNA聚合酶購自日本TaKaRa公司。

1.3 儀器ABI ViiA 7熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Hema9600基因擴增儀(珠海黑馬醫學儀器有限公司)；熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；Multiskan FC酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；高速冷凍離心機(美國Eppendorf公司)；蛋白電泳與轉膜系統 (美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 模型構建與動物分組48只小鼠隨機分為對照組、模型組、治療組，每組16只。模型組和治療組小鼠每天給予30 mg·kg-1MPTP腹腔注射1次，連續注射7 d，建立亞急性PD模型，對照組小鼠同時給予等量生理鹽水；治療組小鼠在MPTP腹腔注射的同時再給予褪黑激素(10 mg·kg-1)腹腔注射，連續給藥14 d，對照組和模型組同時給予等量生理鹽水。給藥結束正常飼養3 d后，處死分離腦組織，組織切片或裂解，以待進一步分析檢測。

2.2 免疫組化檢測黑質區TH、Iba-1表達隨機選取各組小鼠，快速斷頭取腦，分離中腦黑質組織，石蠟切片，厚度為20 μm，每連續5張切片取1張，分別行TH 和Iba-1染色。切片用0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗3次，每次5 min；再用3% H2O2滅活內源性過氧化氫酶，0.1 mol·L-1PBS沖洗3次，每次5 min；5% 牛血清蛋白封閉液室溫封閉30 min；加入適量兔抗小鼠TH、Iba-1一抗(1 ∶100)，4 ℃濕盒內孵育過夜；0.1 mol·L-1PBS沖洗3次，每次5 min；加入山羊抗兔二抗，室溫孵育20 min，0.1 mol·L-1PBS沖洗3次，每次5 min；加入生物素標記室溫孵育40 min；經PBS沖洗后二氨基聯苯胺顯色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、光鏡下觀察并攝片。應用Image-Pro Plus 6.0圖形分析軟件分析黑質區TH陽性細胞的相對吸光度值，并在顯微鏡下對黑質區Iba-1陽性細胞進行計數。

2.3 氧化應激及炎癥因子水平檢測隨機選取各組小鼠，快速斷頭處死，分離中腦組織，組織剪碎，加適量組織裂解液，低溫勻漿機中研磨完全裂解，4 ℃，10 000 r·min-1離心15 min，取上清，保存于-20 ℃冰箱中待測。用酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法嚴格按說明書操作步驟檢測腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α，TNF-α)和白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)含量，采用硫代巴比妥酸比色法檢測丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量，分別采用DCFH-DA熒光探針、黃嘌呤氧化酶法測定中腦組織活性氧(reactive oxygen species，ROS)、SOD水平。

2.4 實時定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)分析SIRT3 mRNA水平按照試劑盒步驟提取RNA，去基因組，檢測純度無蛋白質污染，配制逆轉錄反應液，輕柔混勻后進行逆轉錄反應，條件如下：42 ℃ 60 min，72 ℃ 15 min，-20 ℃保存備用。SIRT3基因引物序列：上游引物5′-ATGCCTGAAGACAGCTCCAACAC-3′，下游引物5′-AGACATCCCTGGTCAGCCTTTCC-3′；GAPDH基因引物序列：上游引物5′-GGAGAAACCTGCCAAGTATGATGAC-3′，下游引物5′-GAGACAACCTGGTCCTCAGTGTA-3′。按照Premix TaqⅡ試劑盒反應體系加入試劑和引物，進行PCR反應。反應條件為：95 ℃預變性5 min：95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，45個循環；72 ℃延伸10 min。通過細胞閾值循環數值和標準曲線，對樣品初始cDNA進行相對量計算。

2.5 Western blot檢測蛋白表達水平隨機選取各組小鼠，快速斷頭取腦，分離中腦黑質組織，組織剪切，加入蛋白裂解液，低溫勻漿機中研磨，充分裂解后，4 ℃，10 000 r·min-1離心15 min，取上清。采用BCA法測定各樣品總蛋白濃度，調整蛋白濃度，沸水浴5 min使蛋白變性，蛋白上樣量為每孔20 μg，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓轉至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入封閉液稀釋的SIRT3、Iba-1、SOD2、iNOS抗體和內參GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜緩沖液(Tris buffered saline tween，TBST)洗膜，加入相應二抗室溫孵育2 h，再用TBST洗膜，膜放于電化學發光液中反應2 min，保鮮膜封閉，暗室中用X膠片感光、顯影、定影、掃描保存圖片。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析目標蛋白表達條帶的灰度值，以GAPDH蛋白表達量作為內參。

3 結果

3.1 褪黑激素干預對黑質多巴胺能神經元數目的影響免疫組化結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠黑質區TH陽性細胞數目顯著減少(P<0.05)，褪黑激素干預后，治療組小鼠黑質區TH陽性細胞數目則明顯多于模型組，差異比較具有統計學意義(P<0.05)，見Fig 1。

3.2 褪黑激素干預對黑質小膠質細胞激活的作用與對照組比較，模型組小鼠黑質區Iba-1陽性細胞數目明顯增多(P<0.05)，褪黑激素干預后，治療組小鼠黑質區Iba-1陽性細胞數目則明顯少于模型組，兩組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)，見Fig 2。Western blot檢測結果也表明，模型組小鼠黑質組織Iba-1表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，與模型組比較，治療組Iba-1表達水平則顯著降低(P<0.05)，見Fig 3。

Fig 2 Effect of melatonin on number of Iba-1-positive cells in substantia nigra of PD mice n=4)

3.3 褪黑激素干預對中腦組織氧化應激及炎癥因子水平的影響ELISA檢測結果表明，模型組小鼠中腦組織氧化應激指標ROS和MDA、炎癥因子TNF-α和IL-1β水平均高于對照組(P<0.05)，SOD活性低于對照組(P<0.05)。褪黑激素干預后，治療組小鼠中腦組織氧化應激及炎癥均獲得一定程度改善，ROS、MDA、TNF-α和IL-1β水平降低，SOD活性增強，組間比較差異均具有統計學意義(P<0.05)，見Tab 1。

Fig 3 Effect of melatonin on Iba-1 protein expression in substantia nigra of PD mice n=4)

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsmodel.

Tab 1 Effects of melatonin on oxidative stress and inflammatory factors in midbrain tissue of PD mice n=16)

3.4 褪黑激素干預對黑質SIRT3 mRNA水平的影響實時定量PCR結果顯示，與對照組比較，模型組黑質組織SIRT3 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，褪黑激素干預后，治療組黑質組織SIRT3 mRNA水平相比模型組表現出一定程度提升，差異具有統計學意義(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 4 Effect of melatonin on level of SIRT3 mRNA expression in substantia nigra of PD mice n=4)

3.5 褪黑激素干預對黑質SIRT3及相關蛋白表達的作用免疫熒光結果表明，與對照組比較，模型組黑質組織SIRT3染色熒光強度明顯減弱(P<0.05)，與模型組比較，治療組熒光則顯著增強(P<0.05)，見Fig 5。Western blot結果顯示，與對照組比較，模型組黑質組織SIRT3、SOD2蛋白表達量明顯減小(P<0.05)，iNOS表達量顯著增多(P<0.05)，褪黑激素干預后，治療組黑質組織3種蛋白表達則呈現相反的變化趨勢，與模型組比較均具有統計學意義(P<0.05)，見Fig 6。

Fig 5 Effects of melatonin on expression of SIRT3 in substantia nigra of PD mice by immunofluorescence n=4)

4 討論

本研究發現，褪黑激素能夠減少MPTP所致PD小鼠黑質多巴胺能神經元的丟失，并抑制小膠質細胞活化，與Naskar等[9]研究結果一致。此外，Bassani等[10]發現，在魚藤酮大鼠PD模型上，褪黑激素保護TH陽性神經元及維持多巴胺水平，褪黑激素在6-羥基多巴大鼠PD模型形成4 d后仍可改善運動癥狀，同時還可減少TH陽性神經元的壞死并能保護紋狀體內神經元的超微結構。

本研究還發現，褪黑激素可降低PD模型小鼠中腦組織ROS、MDA、TNF-α、IL-1β水平，增強SOD活性，從而抑制氧化應激及炎癥損傷。毛崇丹等[11]研究顯示，褪黑激素能提高小鼠蛛網膜下腔出血后神經細胞的存活率，增加腦組織谷胱甘肽水平，減少腦神經元凋亡，降低MDA水平，抑制IL-1β與IL-6分泌，發揮神經保護作用；褪黑激素可提高創傷性腦損傷小鼠腦組織抗氧化酶SOD等的含量，抵抗氧化應激傷害。Paul等[12]研究表明，褪黑激素可改善同型半胱氨酸所致PD大鼠的行為異常、多巴胺能神經元丟失及氧化應激，提高谷胱甘肽水平和抗氧化酶活性，以上文獻報道為本研究結論提供支持。

Fig 6 Effects of melatonin on expression of SIRT3 and its downstream proteins in substantia nigra of PD mice by Western blot n=4)

研究報道，褪黑激素通過上調SIRT3表達、提高SOD2活性抵抗心肌缺血/再灌注損傷[7]；還通過SIRT3-SOD2信號通路緩解膽汁酸誘導的肝細胞線粒體氧化應激[13]。褪黑激素還可通過SIRT3-SOD2-ROS途徑促進自噬，進而減輕重金屬鎘誘發的肝臟毒性[14]。在缺血性卒中模型小鼠中，褪黑素通過激活SIRT1信號通路，減輕線粒體氧化應激損傷和細胞死亡[15]。本研究結果顯示，褪黑激素可通過上調SIRT3、SOD2基因表達，下調iNOS蛋白表達，緩解MPTP所致多巴胺能神經元損傷，作用機制與相關報道結果一致。

綜上所述，褪黑激素干預后，MPTP所致PD小鼠中腦黑質TH表達增多、Iba-1表達減少，ROS與炎癥因子水平下降，SIRT3、SOD2基因表達上調，iNOS基因表達下調，結果表明，褪黑激素通過SIRT3-SOD2信號通路抵抗PD多巴胺能神經元損傷，作用機制與其抑制小膠質細胞激活，及減輕氧化應激與炎癥損傷有關。

(致謝: 本實驗是在玉林師范學院生命科學實驗中心和廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室完成，感謝各位老師的指導與幫助，另外還要感謝南方醫科大學珠江醫院藥學部實驗室老師給予的幫助。)