超聲微泡靶向遞送MaFGF改善糖尿病心肌病大鼠左心室收縮功能的初步實驗研究

遲婷婷 滕銀燕 孫瑋明 林海霞 鄭磊 田新橋

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）作為糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者嚴重且常見的并發癥之一，伴隨DM患者數量的增長而迅速增多，已成為DM患者發生心力衰竭的重要原因。因此，DCM的防治研究成為近些年醫學領域亟待解決的問題。有學者基于酸性成纖維細胞生長因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）特點[1-2]，構建了aFGF的突變體，即改構型酸性成纖維細胞生長因子（modified acidic fibroblast growth factor，MaFGF），經實驗證實MaFGF在改善心功能障礙方面極具前景[3-4]，但因其穩定性差[5-6]，易失活，且目前缺乏高效的靶器官速遞技術，使藥效得不到充分發揮，限制其臨床應用與開發。超聲靶向微泡擊破技術（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD） 恰是超聲醫學領域新興靶向傳輸技術，是利用超聲波空化效應與聲孔效應增加血管內皮通透性，增加外源性物質到達靶位的數量，從而發揮更強生物學作用，在心血管疾病防治方面發揮越來越大的價值[7-9]。因此，本研究擬應用UTMD技術將MaFGF靶向遞送到DCM大鼠的左心室，再應用超聲心動圖、速度向量成像（velocity vector imaging，VVI）及病理學檢查等多種方法評價其對DCM大鼠左心室收縮功能的改善價值。旨在為DCM的防治研究提供更多的實驗數據與方法，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠75只，鼠齡 40～50d，體重（210±25）g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（浙）2019-0001]；MaFGF凍干粉由溫州醫科大學生物與天然藥物開發中心有限公司提供；微泡對比劑采用SonoVue（Bracco公司，產品批號：18A022A）。實驗采用Acuson Sequoia 512C彩色多普勒超聲診斷儀（Siemens公司），線陣探頭（15L8w-S），頻率12 ～14 MHz。TUNEL試劑盒購自羅氏公司（批號：11684817910），鏈脲佐菌素（STZ，批號：WXBC6558V）、天狼星紅染色試劑（批號：29384K）購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 制備MaFGF的超聲微泡混懸液 50μg MaFGF凍干粉與5ml 0.5%氯化鈉溶液混合，輕度振搖充分溶解后形成單純MaFGF溶液。再將5 ml單純MaFGF溶液注入SonoVue瓶中，形成MaFGF-SonoVue混懸液，臨用前持續振蕩搖勻。結合既往研究使用的MaFGFSonoVue混懸液中含MaFGF的濃度為10μg/ml[3]。

1.2.2 動物模型建立、分組和干預 75只大鼠在通風恒溫的SPF級動物房內適應性飼養1周（室溫約20～24℃，平均濕度約50%～60%，人工控制開關模擬晝夜變化，飼養過程中無菌水自由供給），禁食不禁水12h。采用隨機數字表法挑選15只作為N組，不做干預，余60只經腹腔一次性注射70mg/kg的STZ（使用前用pH為4.5的檸檬酸緩沖液稀釋為1%溶液）誘導建立DM模型，分別于注射后第1天、第3天、第7天尾靜脈取血測空腹血糖濃度，血糖濃度持續穩定在16.7mmol/L以上，且出現多飲、多食、多尿現象后，繼續高糖、高脂飲食飼養8周，研究發現DM大鼠8周后就出現心功能異常，即認為形成DCM模型[10]。將造模成功52只大鼠（剔除8只造模未成功）采用隨機數字表法分為4組，分別為DCM 組 、MaFGF 組 、MaFGF-SonoVue 組 、MaFGFSonoVue+UTMD組，每組13只。

N組及DCM組不做干預處理，MaFGF組及MaFGFSonoVue組大鼠由10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3ml/kg）后分別經尾靜脈一次性緩慢推注MaFGF溶液及（MaFGF-SonoVue）混懸液，1min內完成注射。MaFGFSonoVue+UTMD組大鼠麻醉后，剃掉心前區鼠毛，將超聲儀探頭置于心前區皮膚，取乳頭肌水平左室短軸切面，聚焦深度為 3.5～4.0 cm，經尾靜脈一次性緩慢推注MaFGF-SonoVue混懸液，1min內完成，當心肌內見大量微泡充盈時即用機器自帶的MBD功能反復多次爆破微泡（機械指數MI=1.9），直至微泡完全消失。實驗大鼠給藥劑量為15μg/kg。每周干預2次，連續4周。

1.2.3 圖像及數據采集 干預4周后，所有大鼠逐個稱重、記錄數據，麻醉后連接心電圖，行常規超聲心動圖檢查，測量各組大鼠的左心室舒張末期內徑（LVIDd）、左心室收縮末期內徑（LVIDs）、左心室射血分數（LVEF）及左心室短軸縮短率（LVFS）。隨后啟動VVI成像模式，于乳頭肌水平左心室短軸觀采集連續3個心動周期的二維灰階動態圖像，存入MO光盤，然后導入Siemens Sygno US Workplace 3.01分析軟件進行分析，測定左心室6個室壁節段的收縮期平均峰值速度（Vs）、徑向應變（Sr）及徑向應變率（SRr）。

1.2.4 心肌細胞凋亡指數（AI）檢測 處死大鼠，打開心包，剔出左心室，取乳頭肌水平左心室心肌，置于10%的甲醛溶液中固定24h，石蠟包埋，連續約5μm切片，按照試劑盒指示進行TUNEL染色，光學顯微鏡下進行觀察。每組取12張切片，每張切片隨機取20個400倍視野，計數該視野細胞中染色陽性的細胞數，AI（%）=視野內的陽性細胞數/視野內總的細胞數×100%。

1.2.5 血管周圍膠原面積與血管腔面積之比（PVCA/LA）檢測 取每組大鼠心肌組織切片，按照試劑盒說明書進行天狼星紅染色。封片后置于光學顯微鏡下觀察，隨后應用IPP6.0軟件分析計算PVCA/LA，每組取12張切片，每張切片隨機取20個400倍視野。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。數據進行正態性檢驗，計量資料以表示，多組樣本均數比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。方差齊性者兩兩比較采用LSD-t檢驗；方差不齊者采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 實驗結束，N組無死亡，DCM組死亡4只，MaFGF組及MaFGF-SonoVue組各死亡3只，MaFGF-SonoVue+UTMD組死亡2只。

2.2 各組大鼠常規超聲心動圖及VVI指標比較 見表1。

表1 超聲心動圖比較及VVI指標比較

由表1可見，干預4周后，DCM組LVIDd及LVIDs均較 N 組增加（均 P＜0.05），而 LVEF、LVFS、Vs、Sr及SRr卻明顯下降（均 P＜0.05）；MaFGF 組和 MaFGFSonoVue 組 LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr較 DCM 組上升（均 P＜0.05），LVIDs 卻減低（均 P＜0.05），但兩組間無明顯差異；MaFGF-SonoVue+UTMD組LVIDd及LVIDs均較 DCM 組降低（均 P＜0.05），且 LVEF、LVFS、Vs、Sr、SRr較MaFGF組及MaFGF-SonoVue組均明顯升高（均 P＜0.05）。

2.3 病理學檢查結果 TUNEL染色示凋亡細胞核呈棕黃色，正常細胞核呈藍色，干預4周后，N組心肌僅有極少數細胞發生凋亡（插頁圖1a）；DCM組細胞凋亡增多（插頁圖1b）；MaFGF組及MaFGF-SonoVue組凋亡細胞數目相近，但較DCM組減少（插頁圖1c、d）。MaFGFSonoVue+UTMD組凋亡細胞數較其他治療組減少（插頁圖 1e）。

天狼星紅染色顯示DCM組血管周圍纖維化情況較N組明顯增多（插頁圖2a、b），MaFGF組及 MaFGFSonoVue組均較DCM組略好轉（插頁圖2c、d）；MaFGFSonoVue+UTMD組較其他治療組好轉（插頁圖2e）。

2.4 各組大鼠AI及PVCA/LA比較 見表2。

表2 各組大鼠AI及PVCA/LA比較

由表2可見，DCM組AI及PVCA/LA均較N組明顯升高（均 P＜0.05）；MaFGF 組及 MaFGF-SonoVue組間AI及PVCA/LA均無統計學差異，但較DCM組均略下降 （均 P＜0.05）；MaFGF-SonoVue+UTMD 組 AI及PVCA/LA較其他治療組均明顯下降（均P＜0.05）。

3 討論

DCM的概念是Hamby于1974年首次提出[11]，是指獨立于DM基礎心肌組織發生結構與功能的損傷，逐漸進展將導致充血性心力衰竭、心律失常及心源性休克，已成為DM患者死亡的重要原因之一。目前DCM確切發病機制尚不明確，但普遍認可針對抗氧化應激損傷、誘導心肌血管生成、改善心肌微循環狀態、抗心肌細胞凋亡及纖維化治療等是DCM防治的重要策略[12]。因此具有抗氧化損傷、擴張血管、營養神經及保護心臟等功能的aFGF成為具有治療DCM潛力的藥物，但aFGF同時兼具誘發腫瘤風險，限制其應用，于是我們使用具有aFGF同等心臟保護作用的突變體，即MaFGF。研究發現，在冠心病大鼠模型心肌組織中注射MaFGF可顯著減少心肌細胞凋亡并改善心功能[5]，另有研究表明MaFGF可能通過抗氧化應激來抑制DM誘導的心功能障礙[6]。然而MaFGF是一種穩定性較差的生物大分子藥物，在體外極易失活，全身給藥不良反應大，目前缺乏安全、速效、可控的靶向給藥手段，以至MaFGF無法得到開發與推廣。

UTMD恰是超聲醫學領域發展較快的靶向遞藥技術，具有靶向性強、侵襲性低、免疫原性低、毒性低、組織特異性及可重復性等優點[13]。田新橋等[14]利用UTMD遞送aFGF有效改善DCM大鼠的左心室收縮功能。張明等[15-16]利用UTMD技術將分別包載bFGF、aFGF的納米粒靶向遞送到DM誘導的心肌組織中，結果明顯延緩DCM進程，改善心臟功能，減輕心肌細胞纖維化和凋亡現象，提升心肌組織微血管密度。可見UTMD技術為MaFGF靶向治療DCM實驗研究提供了一種全新的方法。

我們利用UTMD技術將MaFGF送達DCM大鼠心肌組織后及時爆破，觀察該靶向給藥系統下DCM大鼠的左心室收縮功能變化。實驗末，應用常規超聲及VVI檢測發現：DCM組LVIDd及LVIDs均較N組增加，而LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr明顯減低，說明 DCM 大鼠左心室功能明顯受損；經TUNEL染色及天狼星紅染色后顯示：AI及PVCA/LA較N組明顯增高，說明DCM組大鼠出現明顯細胞凋亡及血管周圍纖維化現象。而經過MaFGF及MaFGF-SonoVue治療后較DCM組 LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr增高，LVIDs、AI及 PVCA/LA 降低，說明大鼠左心室收縮功能、細胞凋亡及間質纖維化現象得到改善，但兩種方法療效沒有差異性。MaFGFSonoVue+UTMD 組大鼠 LVEF、LVFS、Vs、Sr及 SRr較其他治療組明顯增高，說明UTMD技術可提高藥物對左心室收縮功能療效，AI及PVCA/LA明顯降低，可見MaFGF保護心肌的機制可能是從抗細胞凋亡、抗間質纖維化方面發揮作用。總之，UTMD靶向遞藥系統為DCM防治提供了一種全新的靶向輸藥手段，在臨床應用上極具前景，MaFGF有望成為治療DCM的研究方向。

本研究尚存在一些不足，治療組之間LVIDd無明顯改善，可能是因為給藥時間短或者樣本數量較小，超聲微泡作為藥物或者基因的載體，載藥量較低，穩定性較差，局部維持時間較短，有待進一步優化。