胸腔積液中IL-33、ADA及外周血T-SPOT.TB聯合檢測對結核性胸膜炎的診斷價值

金芬華 王道會 林慧 彭燕平 何劍波 夏曉東

結核性胸膜炎是常見的一種肺外結核病。胸膜活檢和細菌學檢測是結核性胸膜炎診斷的金標準，但因胸膜活檢的創傷性、結核桿菌培養困難等原因使診斷較為困難[1-2]。隨著近年來酶學和分子生物學的不斷發展，酶類及細胞因子在各種免疫性疾病的發病機制中越來越受到關注[3]。腺苷脫氨酶（adenosinedeaminase,ADA）存在于人體各組織，主要參與嘌呤核苷的分解，近年來臨床上廣泛用于結核病的診斷[4]。ADA檢測是目前所公認的一種診斷結核性胸膜炎的理想指標[5]。結核感染T細胞斑點試驗（tuberculosis T cell spot detection，T-SPOT.TB） 屬于干擾素-γ 釋放試驗（interferon-γrelealseassay，IGRA）的一種。該法主要利用結核特異性抗原（EAST-6，CFP-10）通過酶聯免疫斑點技術（enzymelinked immunospotassay,ELISPOT）檢測結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）特異性抗原刺激外周血單個核細胞分泌干擾素 γ(interferon-γ，IFN-γ)的T細胞數,可作為結核病早期臨床診斷的輔助方法[6-7]。研究顯示在結核性胸膜炎患者胸腔積液中白介素（interleukin，IL）-33的水平明顯高于其他病因引起的胸腔積液[8-10]。因此，我們推測IL-33可能在結核性胸腔積液（tuberculous pleural effusion，TPE）的產生中扮演重要角色。本研究通過分析胸腔積液中IL-33與ADA、外周血T-SPOT.TB的相關性，以及3者聯合檢測對結核性胸膜炎的診斷價值，旨在為臨床診斷結核性胸膜炎提供參考，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2017年6月至2018年12月在本院呼吸內科住院的胸腔積液患者79例，其中男52例，女27例，年齡 16～89（48±20）歲。根據診斷結果分為兩組，TPE 組 57例，男 41 例，女 16 例，年齡 16～89（39±18）歲；非TPE組22例（惡性胸腔積液17例，類肺炎性胸腔積液 5例），男 11 例，女 11 例，年齡 41～88（63±13）歲。兩組患者性別比較差異無統計學意義（P＞0.05），年齡比較差異有統計學意義（P＜0.05）。納入標準：（1）TPE：①胸腔積液檢測到抗酸桿菌和（或）在胸膜活檢樣本中發現肉芽腫樣改變者，并能排除其它原因所導致的肉芽腫性胸膜炎；②根據胸腔積液Light標準若符合滲出性改變，抗結核治療，胸腔積液吸收，并且臨床癥狀緩解。（2）非TPE：包括惡性胸腔積液和類肺炎性胸腔積液。①惡性胸腔積液：影像學結果符合原發性支氣管肺癌并發胸腔積液；經纖維支氣管鏡或者胸腔鏡取得的肺部組織活檢其病理學確診為肺癌；胸腔積液脫落細胞學檢查檢測到轉移性腫瘤細胞。②類肺炎性胸腔積液：有咳嗽、咳痰和發熱癥狀，且胸部影像學檢查提示肺部滲出影，并經抗生素治療后胸水吸收。排除標準：符合以下任意一項者，（1）患者在入院前半年內，罹患有胸部外傷者或接受關于創性胸膜腔檢查治療者；（2）患者曾接受過抗腫瘤或抗結核治療；（3）患者使用過糖皮質激素、非甾體抗炎藥，或免疫抑制劑者；（4）患者胸腔積液的病因診斷不明確者；（5）風濕免疫性疾病等導致的胸腔積液患者。本研究經溫州醫科大學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 胸腔積液患者住院經超聲定位行胸腔穿刺置管術收集引流液5ml，與500U/ml的淡肝素混合，3 000r/min離心10min，收集上清液置于-80℃冰箱保存，待測定IL-33；收集引流液10ml送本院檢驗科化驗室測定 ADA、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）。采集入選者外周晨起空腹肘靜脈血5ml送本院檢驗科化驗室進行T-SPOT.TB測定。

1.2.2 檢測方法 胸腔積液中IL-33的測定采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法，試劑盒由英國abcam公司提供，操作步驟均嚴格按照說明書進行。ADA、LDH檢測由本院檢驗科醫師采用德國西門子AVDIA2400全自動生化儀協助檢測完成。外周血T-SPOT.TB檢測由本院檢驗科醫師按照說明書嚴格操作，TB-IGRA培養管由廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司提供。

1.3 統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件，符合正態分布的計量資料以表示；非正態分布的計量資料以中位數（四分位間距）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗。相關性分析采用Pearson相關。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線，最佳臨界值依據約登指數（敏感度+特異度-1）確定。計算IL-33水平對結核性胸膜炎的最佳診斷閾值及相應的敏感度和特異度。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組患者胸腔積液中IL-33、ADA、LDH水平和外周血T-SPOT.TB水平比較 見表1。

表1 各組患者胸腔積液中IL-33、ADA、LDH和外周血T-SPOT.TB水平比較

由表1可見，TPE組患者胸腔積液中ADA、IL-33及外周血T-SPOT.TB水平明顯高于非TPE組患者，差異均有統計學意義（均 P＜0.01）。

2.2 胸腔積液中IL-33水平與ADA水平、外周血TSPOT.TB水平的相關性分析 見圖1、圖2。

圖2 胸腔積液中IL-33水平與外周血T-SPOT.TB水平的相關性分析散點圖

由圖1、2可見，胸腔積液中IL-33水平與ADA、外周血 T-SPOT.TB 水平均呈正相關 （r=0.343、0.450，均P＜0.05）。

2.3 胸腔積液中ADA、IL-33和外周血T-SPOT.TB水平對結核性胸膜炎的診斷價值 見表2、圖3。

表2 胸腔積液中IL-33、ADA和外周血T-SPOT.TB對結核性胸膜炎的診斷價值

圖3 胸腔積液中ADA、IL-33和外周血T-SPOT.TB對結核性胸膜炎診斷的ROC曲線

由表2、圖3可見，胸腔積液中IL-33、ADA水平和外周血 T-SPOT.TB診斷 TPE 的 AUC分別為 0.753、0.912 和 0.865，靈敏度分別為 49.1%、93.0%和 92.3%，特異度分別為 100.0%、90.9%和 71.4%。

2.4 胸腔積液中 IL-33、ADA和外周血 T-SPOT.TB 3者聯合檢測對結核性胸膜炎的診斷價值 見表3。

表3 胸腔積液中IL-33、ADA和外周血T-SPOT.TB 3者聯合檢測對結核性胸膜炎的診斷價值

由表3可見，胸腔積液IL-33、ADA和外周血TSPOT.TB 3 者聯合檢測時 AUC 最大，為 0.962，特異度100.0%，靈敏度 88.5%。

3 討論

結核性胸膜炎是導致胸腔積液的最常見病因，占我國胸腔積液住院患者病因的 49.5%～54.5%[11]。臨床醫生需要一種快速有效的檢測方法，以便早期診治TPE患者，減少因TPE所致的結核性膿胸、肺毀損等并發癥[12]。

IL-33由Schmitz等[13]2005年證實，屬于IL-1類細胞因子超家族新成員，具有家族成員相似的同源性結構三葉草形結構。本研究結果顯示，結核性胸膜炎患者胸腔積液中IL-33水平明顯高于非TPE，TPE中IL-33的AUC 為 0.753，以 155.96ng/L為最佳截斷值時靈敏度為49.1%，特異度為100%。胸腔積液中IL-33水平與ADA、外周血T-SPOT.TB均呈正相關。Lee和Xuan等[9-10]發現，結核性胸膜炎患者胸腔積液中IL-33水平明顯高于其他病因積液和自身血清水平，其靈敏度分別為78%和86.96%，特異度分別為65%和90.48%。與本研究類似，Lee等[9]的研究結果提示胸腔積液中IL-33水平與ADA呈明顯正相關。Li等[8]的研究也顯示，IL-33診斷結核性胸膜炎的靈敏度為83.9%，特異度為87.3%，AUC為0.823。所以，以上證據顯示，與非TPE相比，IL-33與TPE的病理生理更有相關性。雖然我們沒有明確IL-33對TPE發病的具體作用機制，但本研究所觀察到的IL-33與結核性胸膜炎之間的關系可以通過以下假設來解釋：IL-33在一定程度上有免疫調節效應，如誘導細胞因子和應答細胞。越來越多的基礎研究顯示，IL-33可以通過增加IFN-γ參與調解增強Th1細胞免疫反應[14-16]。研究還發現，IL-33的表達由IFN-γ和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）上調[17-18]。因此，IFN-γ不只是IL-33的上游調節因子，同時也是IL-33信號的下游產物[15-16，19]。所以，在結核性胸膜炎中IL-33和IFN-γ可能形成偶聯的正反饋回路[15-20]。所以，IL-33可能參與結核性胸膜炎的發病和發展，其水平升高可能為結核桿菌在胸膜局部刺激的作用，IL-33對結核性胸膜炎的診斷具有重要應用價值。

ADA是嘌呤核苷代謝的一種重要酶類，主要存在于人體各組織，特別是淋巴細胞中。結核性胸膜炎發病機制是MTB感染引起機體產生遲發型超敏反應，MTB的結核蛋白進入胸膜腔引起胸膜炎癥反應，導致淋巴細胞分化增殖，引起ADA含量升高[4]。ADA是最廣泛研究和推薦的生物標志物之一，并且已經發現其在診斷TPE方面具有良好的性能。一篇包含63項研究的薈萃分析評估了胸腔積液中ADA活性在鑒別TPE和非TPE的價值，證明了其高靈敏度和特異度（分別為92%和90%）[21]。本研究結果顯示，結核性胸膜炎患者胸腔積液中ADA水平明顯高于非TPE，其診斷結核性胸膜炎靈敏度為93.0%，特異度為90.9%，與Meta分析研究中ADA特異度（90.0%）相似[21]。

結核性胸膜炎的主要免疫方式是細胞免疫，T細胞在受到MTB抗原刺激后,活化分泌細胞因子IFN-γ參與免疫應答，患者外周血中存在對應的特異T細胞[22]。T-SPOT.TB檢測的原理是通過分離外周血MTB特異性T細胞，經體外培養和抗原再次刺激后分泌IFN-γ,以相應抗體檢驗IFN-γ濃度來診斷是否存在MTB感染。據文獻報道，其診斷價值不受患者性別、年齡、腫瘤、免疫抑制等影響，不僅可用于肺外結核病的診斷，還可以作為治療效果評估，具有較高的應用價值[23]。本研究結果顯示，MTB組的外周血T-SPOT.TB水平明顯高于非MTB組，外周血T-SPOT.TB對TPE的靈敏度為92.3%，特異度為71.4%。但研究顯示外周血T-SPOT.TB存在自身缺陷，易受外周血T淋巴細胞數量的影響[24]，尤其是免疫缺陷的胸腔積液患者[25]，常會出現假陰性結果。且外周血 T-SPOT.TB不能鑒別MTB潛伏感染還是活動性結核病，致使診斷活動性結核病的特異度受限制。

綜上所述，本研究發現IL-33的特異度最高，為100.0%，對于排除結核性胸膜炎的意義重大，但靈敏度不高，只有 49.1%。然而，IL-33聯合 T-SPOT.TB 檢測診斷特異度為100.0%，靈敏度升高，為76.9%。聯合IL-33+ADA+T-SPOT.TB檢測診斷特異度為100.0%，靈敏度為88.5%，提示聯合檢測對結核性胸膜炎具有更高診斷價值，有利于早發現、早治療，對結核性胸膜炎有重要的輔助診斷價值。