代謝組學在慢性阻塞性肺疾病中西醫臨床診斷中的研究進展

張瑞，黃慶松，黃雪元

(上海市嘉定區中醫醫院內科，上海 201800)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是以持續性氣流受限和不可逆的氣道阻塞為特征，目前全球大約有300萬人患有該疾病，到2020年COPD將會是全球第三大死亡原因[1]。因此，進一步研究COPD的發病機制及防治措施非常重要。COPD屬于中醫學“肺脹病”范疇，目前中醫藥在COPD診治中取得了眾多成就，但中醫證候缺乏明確統一的客觀化、量化指標，阻礙了臨床證型診斷的統一，也對臨床治療造成一定的困擾。同時西醫傳統的COPD臨床診斷方法諸如肺功能檢測、支氣管鏡檢測并不能適用于每一例患者。并且基于COPD特異性及表型復雜性特征，傳統的診斷方法缺少特異性診斷和治療評價體系。

代謝組學技術研究的是作為各種代謝路徑的底物或產物的小分子代謝物，在精準醫學的時代廣泛應用于COPD診斷、藥物療效評價體系中。目前雖然對于CODP確切的生物標記物沒有被完全證實，但是對于COPD的早期診斷和藥物作用機制仍有非常重要的指導意義?，F就近年來代謝組學技術在COPD中西醫診斷中的進展作如下綜述。

1 代謝組學在COPD西醫診斷中的研究

慢性阻塞性肺疾病生物標志物涉及氨基酸代謝、脂肪代謝、能量代謝、氧化應激反應等。

1.1 氨基酸代謝障礙和CODP

氨基酸代謝異常與營養狀況、炎癥反應和氧化應激相關[2]。COPD患者肺外表現常有體重減輕、營養不良、骨骼肌功能障礙[3]。COPD急性加重期呼吸肌疲勞可導致代謝亢進，表現在低體重患者中支鏈氨基酸減少[4]。在老年COPD患者中補充支鏈氨基酸可促進蛋白合成[5]。谷氨酸鹽和谷氨酰胺在抗氧化和生物合成中發揮重要作用。谷氨酸大部分主要谷氨酸轉運體(GLT-1，GLAST)所攝取，被谷氨酰胺合成酶(Gs)轉化為谷氨酰胺，谷氨酰胺再被轉運回合成谷氨酸，參與谷氨酸-谷氨酰胺循環。谷氨酰胺是體內含量最多的條件必需氨基酸之一，作為免疫系統的主要能量來源能夠促進蛋白合成，在改善COPD患者免疫功能及營養方面具有顯著效果[6]。谷氨酰胺可促進常年腸道細胞ATP生成，是腸內能量生成的最大貢獻者，并能提高機體抗氧化能力，減少氧化應激反應[7]。近期發現谷氨酰胺可抑制COPD患者炎性細胞中p38MAPK通路的活化，并下調IL-8的表達，達到抗炎作用[8]。COPD患者中谷氨酸水平升高，提示著骨骼肌蛋白代謝異常和氧化應激反應異常。

1.2 脂質代謝障礙和COPD

COPD相關脂肪代謝障礙主要涉及脂肪酸和磷脂代謝異常。脂肪酸和炎癥有密切的關系，游離脂肪酸和可以活化巨噬細胞，吞噬脂滴，形成泡沫細胞，釋放大量炎性因子，參與炎癥的發生和發展過程[9]。?；舛緣A是脂肪酸的β-氧化代謝(FAO)中間產物，Rutkowsky等[10]發現L-C14肉毒堿作為?；舛緣A的代表，促進炎癥因子IL-8的表達，同時酰基肉毒堿促進了NF-kB的激活，兩者共同促進的炎癥反應通路的進行。Novotna等[11]在研究中發現?；舛緣A含量在COPD患者中較正常人升高，推測COPD患者存在脂肪酸β-氧化反應異常，氧化應激反應增強，能量需求增高現象。Xu等[12]發現COPD異常黑膽質患者中脂肪酸代謝分解中間產物丙酮含量較正常人明顯增高，提示該患者中脂肪分解代謝反應增強，碳水化合物氧化代謝降低。磷脂是構成生物膜的主要成分，COPD患者中鞘磷脂和甘油磷脂均發生代謝異常。鞘脂代謝在調節許多與健康和疾病相關的細胞行為過程中起重要作用，神經酰胺是鞘磷脂分解產物。Bodas等[13]發現在伴隨肺氣腫吸煙COPD患者中鞘脂代謝異常，神經酰胺和神經酰胺/鞘氨醇與非吸煙/非肺氣腫COPD患者比較比例升高。神經酰胺升高可以直接作用與線粒體，破壞內皮系統，導致肺病細胞凋亡，產生巨噬細胞功能異常，促進炎癥反應發生[14]。甘油磷脂代謝主要包括溶血磷脂酰膽堿代謝。溶血磷脂酰膽堿為卵磷脂代謝中間產物，是體內甘油磷脂水溶性結構中最簡單的化合物。劉志剛等[15]對COPD穩定期患者進行HPLC-MS研究，發現溶血磷脂酰膽堿在COPD穩定期患者中較健康人明顯升高。溶血磷脂酰膽堿可激活NF-B并促進炎癥因子的釋放，從而啟動炎癥反應的發生。

1.3 能量代謝障礙和COPD

COPD患者常存在能量代謝失衡，常常由于氣道阻力增加及血氧降低導致靜息能量消耗增加，靜息耗氧量增加，并且多數COPD患者攝入減少，在營養不良及急性發作期的患者中表現尤為突出[16]。COPD患者能量代謝通路涉及糖代謝、磷酸戊糖途徑、TCA循環等異常。COPD患急性加重期引起急性炎癥反應，炎癥反應部位使物質分解加速加重組織耗氧，同時炎癥反應部位微循環障礙影響氧供，引起無氧酵解產生乳酸量增多。同時COPD 病人因長期處于氧供不足的狀態，糖酵解亦產生乳酸增多。血糖可能是影響AECOPD 預后的一個新的預測因，血糖升高的可能原因有胰島素抵抗、治療時加用糖皮質激素、急性應激時升糖激素分泌增多等[17]。AECOPD患者如伴有高血糖時，必將升高血清炎性反應程度，加劇凝血功能紊亂，進一步加重肺功能損傷程度[18]。有研究培養COPD患者氣道平滑肌細胞后，健康不吸煙患者與吸煙患者比較，發現ADP/AMP及磷酸肌酸/肌酸比例減少，無機磷酸鹽水平降低[19]。此研究證明COPD患者道平滑肌細胞ATP能量代謝降低。另外，線粒體是細胞氧化磷酸化和合成ATP的主要場所，是三大物質最終釋放能量的地方。COPD患者骨骼肌線粒體氧化磷酸化參與TCA循環產能，其催化酶的活性降低及線粒體功能障礙將導致能量的生成減少及代謝異常，引起COPD骨骼肌肌力和耐力的下降[20]。

1.4 氧化應激反應和COPD

氧化應激反應是指機體內的活性氧等超氧化物產生過多或消除減少，導致組織損傷。目前認為氧化應激反應在COPD發生、發展中起著主要的作用[21]。目前認為吸煙與COPD的發生密切相關，Paul[22]等觀察了吸煙對THP-1型和人外周血單核細胞中提取的巨噬細胞的影響，研究結果發現吸煙降低了囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)的表達，導致了培養的細胞吞噬作用減慢；吸煙亦可引起細胞呼吸受阻，導致糖酵解增強，產生過多活性氧；自由基清除劑N-乙酰半胱氨酸可減輕吸煙的這些作用，可使細胞吞噬功能恢復正常。FeNO在呼吸道疾病中是炎癥反應的標志，其中NO作為氧化應激產生的自由基是由精氨酸和硝酸鹽反應合成，此二者在COPD患者中均增高導致了NO生成增多[23-24]。Xu等[23]發現L-精氨酸分解代謝從NO合成酶途徑轉變為精氨酸酶途徑導致了氣道阻塞和慢性氣道重構過程。同時NO生物可利用率降低導致硝酸鹽增多，后者可以產生活性氮，加重了氧化應激反應[24]。

2 代謝組學與中醫證候的相關性

中醫認為人是一個有機的整體，生理上各個系統在相輔相成的協同作用和相反相成的制約作用下共同發揮完整功能，病理上任一臟腑功能失調均與全身臟腑氣血、陰陽盛衰相關。因此在診治疾病時，可以將全身外在的變化，統一分析為某種類型的證候進行辨證論治。中醫的證候包括“證”和“候”。證是疾病狀態下某一階段的病機概括，是內因和環境外因共同作用的整體，并隨病程變化，是準確施治的基礎。候是疾病外在的表現，包括癥狀和體征兩大類。通過對機體整體水平表現出來的候認識、歸納為某種證，注重的是主體綜合感覺，與西醫的定位、定性診斷完全不同，不同于某一組織、器官、細胞的病理改變。代謝產物是生命活動的最終產物，代謝組學作為系統生物學的終點，其精髓就是以整體論方法研究生物體系中的構件分子族之間以及機體與環境之間的相互作用網絡，與中醫學的整體觀念一致；同時，代謝組學通過儀器分析和多元統計分析方法研究整體的功能，兩者的本質是相同的[25]。

中醫證隨著病程的發展發生相應的變化，代謝組學研究的不是某一個時間點，而是生命個體所有代謝應答的全貌和動態變化過程，兩者均具有恒動觀。中醫注重辨證，不僅注重疾病中致病因素這一共性, 更注重不同機體的反應性。代謝組學亦具有辨證性，對某一病證相關特定組分的共性加以分析、判斷的同時, 重視發現差異代謝產物(生物標志物)。同時，證候在內在因素和外在因素諸如氣血陰陽、臟腑傳變、病邪性質、入侵途徑等共同作用下，具有多維性，辨證采用的方法也必須是多維的。因此，辨證論治必須根據四診信息抓住主要矛盾，采用降維方法，確定有效方劑，化繁為簡。代謝組學同樣應用降維法分析生物體海量數據。代謝組學在處理儀器設備的大數據圖譜時，必須應用模式識別手段，采用PCA、OPLS-DA等多元統計方法，將海量數據壓縮至我們可以識別、理解的二維、三維模型，具有很強的解釋性。

因此，中醫證候具有整體性、恒動性、多維性和辨證降維性，這些與代謝組學研究方法具有共同思路。利用代謝組學可以研究中醫同病異證性，找到不同證候的差異代謝物，為中醫證本質理論的科學闡述提供客觀物質基礎。

3 代謝組學在COPD中醫證候診斷中的應用

中醫證是準確施治的基礎，但是從古至今，中醫被現代醫學質疑其科學性，中醫證候的診斷依舊是靠著人的“望、聞、問、切”主觀經驗判定，缺乏客觀的量化標準，影響了“證”的準確性與可靠性。代謝組學與中醫學的“整體觀念、辨證論治”是一致的。中醫證候反映了機體整體某一時刻的外在宏觀表現，而代謝組學從整體水平闡明了機體的內在微觀變化，更能揭示中醫證候的本質。通過代謝組學技術發現中醫不同證候的生物標記物及代謝通路，為中醫證準確診斷研究提供現代化科技平臺。在“精準醫學”的時代，眾多學者從代謝組學層面研究COPD中醫證型實質上做出了大量有益的探索，取得了很多研究成果。

3.1 臨床研究

楊秀云等[26]納入30例痰熱壅肺型AECOPD患者采用1HNMR方法觀察患者治療前后血清差異代謝物變化，結果發現急性加重組血清谷氨酸和谷氨酰氨水平、賴氨酸、丙酮酸、3-羥基丁酸等明顯升高, 而極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、脂類及亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、膽堿、組氨酸、1-甲基組氨酸9水平明顯下降。提示痰熱壅肺型COPD急性加重期患者能量代謝和蛋白質代謝紊亂。

孫瑗、李杰[27]采用進行超高效液相色譜-質譜聯用分析檢測26例痰熱壅肺型AECOPD患者及20例非痰熱壅肺型AECOPD患者，與10例健康志愿者對比。結果表明AECOPD患者與健康對照組相比較,共發現53種差異代謝物,主要涉及甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝等9條相關代謝通路；急性加重期痰熱壅肺證組與非痰熱壅肺證組相比,共發現50種小分子差異代謝物,主要涉及甘油磷脂代謝、鞘脂類代謝、亞油酸代謝等7條相關代謝通路。

李澤庚等[28]納入40例肺氣虛型COPD患者，采用HPLC-MS/MS技術對患者尿液進行檢測，結果檢測道13種顯著差異化合物。其中羊毛固醇、膽酸、雙氫尿嘧啶、二十碳烯酸、L-棕櫚脂酰肉堿、吲哚基葡萄糖苷酸、乙烯乙酰氨基乙酸、鈍葉醇、棕櫚酸、3-羥基己二酸、硬脂酰肉堿、異丁酰肉堿減少，甲羥戊酸增多。同時李澤庚等人的課題[15]組采用同樣研究方法檢測該患者血清全譜氨基酸代謝，結果發現15種差異代謝物。其中辛酰甘氨酸、 5-磷酸左旋谷氨酸、3-氨丙醛、13, 14-雙氫-15酮基前列腺素E2、5- (β-羧乙基) -4, 6-二羥基甲基吡啶、N-花生四烯酰甘氨酸、廿十烯酸、脫氧胞苷、二十碳烯酸、8-異-15-酮基前列腺素F2α等升高，十六烷酸、18-氧代皮質醇、脫氧核糖降低。

劉海葉等[29]采用高效液相色譜-質譜聯用儀(HPLC-MS)檢測65例氣陰兩虛型COPD穩定期患者血清，并與30例健康體檢者對比分析，結果發現肌苷酸、三磷酸鳥苷(GTP)、3-甲基組氨酸、組氨酸、抗壞血酸、甘氨酸、α-亞麻酸等9種呈現下降趨勢，其余三種呈上升趨勢；所涉及主要異常的代謝通路有氮代謝、嘌呤代謝、氨基酰-tRNA生物合成、谷胱甘肽代謝、組氨酸代謝等。

徐衛方等[30]采用NMR方法檢測維族人異常黑膽質證COPD穩定期患者血清差異代謝物，并與腎虛痰瘀證和健康組對比分析。發現COPD腎虛痰瘀證與異常黑膽質證患者機體內三大物質代謝紊亂、能量代謝異常, 相比健康人顯示機體的免疫功能更低下、內分泌功能更紊亂、預后更差。

王海明[31]納入17例肺氣虛、15例肺陰虛COPD患者及16例健康患者，采用GC-MS技術檢測受試者呼出氣冷凝液并進行對比分析找到肺氣虛證與肺陰虛證生物標志物。結果發現肺氣虛組2，4，4-三甲基-1，3-雙-異丁酸戊酯含量較健康組增高，7，9-二叔丁基-1-氧雜螺[4，5]-6，9-二烯-2，8-二酮含量降低；肺陰虛組2，4，4-三甲基-1，3-雙-異丁酸戊酯含量較正常組增高，而鄰苯二甲酸二異丁酯含量增高；肺陰虛組與肺氣虛組相比, 雪松醇和雙酚A含量均增高。

3.2 動物實驗研究

動物實驗作為臨床實驗的補充，通過建立動物證候模型，可以找到該證候特異性生物標記物，對中醫證候的規范化、現代科學化亦具有重要作用。但是相對于臨床研究，由于目前對于動物實驗中醫證候造模無統一標準，可重復性以及與臨床證型一致性存在爭議，COPD中醫證本質方面開展動物實驗數據相對較少。劉志剛課題組[32]采用復合木瓜蛋白酶霧化吸入法60天復制COPD肺氣虛證模型大鼠后，運用HPLC-MS/MS技術對大鼠血漿的代謝物進行檢測。結果找到10種差異代謝產物，其中精胺、十二烷二酰肉堿、雙氫神經酰胺、二甲基甘氨酸、四氫葉酸酰-L-谷氨酰、二十碳五烯乙醇胺、4-羥雙氫(神經)鞘氨醇呈下降趨勢，組胺、17-羥基亞麻酸、前列腺素E2呈上升趨勢。同時，課題組繼續檢測該模型大鼠肺組織及尿液標本[33-34]，發現在肺組織中，與健康組對比17-羥基亞麻酸、前列腺素E2增多，四氫葉酸酰-L-谷氨酰、乙烯乙酰氨基乙酸減少；在尿液標本中發現9種差異代謝物，這些不同部位的檢測結果從不同方面證實了肺氣虛證的生物標志物。何麗清等[35]采用復制寒飲蘊肺證大鼠模型，采用核磁共振方法檢測肺組織標本。結果證明，模型組較空白組異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、纈氨酸、丙氨酸、組氨酸和?；撬嵩龈撸K氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸降低，醋氨酸無統計學意義。差異代謝物主要與能量代謝、炎癥反應和免疫有關，運用小青龍湯后差異代謝物能夠有所回調。Li等[36]運用煙熏法聯合氣管滴入肺炎克雷伯菌溶液復制COPD大鼠模型，運用LC-MS技術檢測肺組織發現49種差異代謝物，加以補脾益腎湯干預后11種代謝產物下調，苯丙酮酸和α-d-巖藻糖未產生明顯變化,結果此證明了補脾益腎法在COPD治療中的作用。

綜上所述，COPD代謝組學主要涉及氨基酸代謝、脂肪代謝、能量代謝和氧化應激反應；由于目前國內COPD疾病代謝組學研究方向主要集中在西醫臨床診斷、病理生理機制等研究方面，所涉及的COPD中醫證本質方面研究文獻相對較少。中醫證候方面已開展肺氣虛證、肺陰虛證、氣陰兩虛證、痰熱壅肺證、維族人異常黑膽質證等相關代謝組學研究。盡管現今對COPD中醫證本質代謝組學研究尚不完善，但仍與上述四方面代謝異常相關。

4 問題與展望

代謝組學技術已成功應用于COPD研究領域，為COPD的中西醫臨床診斷提供新的方法，但仍然存在如下問題：(1)代謝組學研究的是體內代謝產物，受到干擾因素如性別、年齡、飲食等較多，另外待測樣品的穩定性甚至取樣方法、樣本保存方法都會改變待測樣品的代謝物譜，導致結果不穩定。因此必須制定嚴格的標準納入臨床病例、保存待測樣本，減少不必要干擾因素。(2)COPD中醫證候動物模型的建立仍處于探索階段，缺乏統一造模標準，模型評價體系、可重復性及與人體臨床證候的一致性也未能得到公認。因此，代謝組學動物實驗仍需結合臨床研究結果，擴大臨床樣本量,必要時進行隨機雙盲對照進一步驗證結果。(3)單一組學研究存在敏感度與特異度低、重復性差等不足。因此，需采用代謝組學聯合蛋白質組學、基因組學、轉錄組學等多組學研究方法開展相關研究，同時未來研究可能挖掘COPD靶向治療位點，進一步促進肺部疾病精準醫學的發展。