腸道菌群調節腸道MicroRNA治療骨質疏松癥

白浩 孫海飚 韓曉強 張子楠 李光明 薛建剛 張錦濤 許磊 馮志國

1.山西醫科大學第一臨床學院，山西 太原 030001 2.山西醫科大學第一醫院骨科，山西 太原 030001

1 骨質疏松癥概述

全身骨骼系統是一個處于動態更新的系統，經歷著不斷重塑的過程，參與該過程的細胞包括成骨細胞和破骨細胞，當動態平衡被打破，趨向于破骨細胞活性相對增強即會導致骨質疏松癥(osteoporosis，OP)[1]。OP的特點是骨量降低，骨組織細胞賴以生存的微環境惡化，最終導致骨折風險增加。OP可根據雌激素缺乏或病理變化分為原發性和繼發性兩種[2]。有報道顯示在美國OP影響了大約5 400萬人，其中50歲及以上的人群中，三分之一的女性和五分之一的男性會因OP而骨折，預計到2025年，因骨質疏松性骨折造成的經濟負擔將超過250億美元[3]。

OP治療目的是防止骨質丟失，改善骨重建不平衡。目前，除了通過健康生活方式干預，還可通過補充維生素D和鈣劑預防治療OP[4]。對于存在高骨折風險的患者，則應及早進行藥物干預治療。但是有報道顯示，目前的抗OP藥物對上消化道存在刺激，嚴重者會引發頜骨骨壞死、骨肉瘤、乳腺癌、不典型轉子下骨折等嚴重不良事件[5]。這推動著人們不斷探索和尋找預防、治療OP的新方案。

2 MicroRNA

2.1MicroRNA概述

MicroRNA(miRNA)是由真核細胞核中內含子或外顯子DNA轉錄而來的，在被輸出到細胞質之前，轉錄形成的初級前體miRNA(pri-miRNA)被加工成含70個堿基對莖環結構前體miRNA。隨后pre-miRNA進入細胞質，由內切酶Dicer將其裂解成小分子的雙鏈RNA片斷，然后將單鏈加載到沉默復合物中(RISC)，形成成熟的miRNA復合物[6]。miRNA能夠結合信使RNA(mRNA)的3’非翻譯區從而抑制mRNA的翻譯過程[7]。研究發現miRNA可能由體內一系列細胞分泌，如腸上皮細胞、免疫細胞、干細胞、血細胞或脂肪細胞，在人體生理或病理狀態下發揮重要作用[8]。miRNA 不僅在細胞內液可以檢測到，且在人的多種體液中，如血液、尿液、唾液及腦脊液中都可檢測到[9]。因此，這使得將miRNA作為疾病診斷依據及治療靶點成為可能。

2.2miRNA與OP

miRNA具有轉錄后調節因子的作用，可參與調節骨形成和吸收中不同的細胞過程[10]。miRNA可通過抑制成骨抑制因子或介導成骨細胞分化，促進間充質干細胞向成骨細胞分化，具有促進骨形成作用[11]。由于miRNA發揮作用具有嚴格的核苷酸配對原則，因此當單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNPs)位于或接近miRNA與mRNA相互識別的區域，即可能破壞miRNA-mRNA的相互作用，最終導致骨代謝異常和OP的發生[12]。與I型前肽(P1NP)和血清C端肽膠原蛋白(CTX)相比，miRNA在體液中往往具有更高的可測性和更強的穩定性[13]。因此，可以看出miRNA不僅是骨代謝過程中的調節因子也可以作為骨代謝標志物進行檢測。據報道，7個miRNA家族的遺傳變異可能影響骨質代謝過程，包括miR-27a、miR-124、miR-125、miR-146a、miR-149、miR-196a2和miR-2861。最近的研究進一步揭示了幾個新的多態性家族(miR-140-5p、miR-149、miR-3679、miR-4274、miR-433、miR-499和pri-miR-34b/c)，這些多態性家族也與OP的發生過程密切相關[14-15]。可見miRNA與骨形成密切相關，并且可用于檢測評估骨代謝情況。隨著相關檢測技術的不斷完善，將有更多具有調節骨代謝作用的miRNAs被發現。

3 腸道菌群與益生菌

3.1腸道菌群與益生菌概述

腸道菌群(gut microbiota，GM)是宿主健康所必需的，在宿主新陳代謝、營養物質吸收利用、病原體抵抗和免疫功能調節等方面發揮著至關重要的作用。GM表達的基因組數量遠約為人類基因組數量的100倍[16]。GM中也含有益生菌，其中乳酸菌、腸球菌、大腸桿菌、雙歧桿菌作為益生菌已被廣泛應用于日常生活中[17]。近年來發現益生菌可能具有預防和治療疾病潛力。

3.2益生菌與OP

益生菌可通過調節腸道內pH值、分泌抗菌肽、增加黏液分泌、調節宿主腸道免疫系統、重構GM結構進而改善腸道上皮組織通透性[18]。Britton等[19]利用12周大Balb / c小鼠制造卵巢切除(ovariectomized，OVX)模型，給予羅伊氏乳桿菌ATCC 6475干預治療后，發現經干預治療后的OVX小鼠與對照組小鼠相比骨密度(bone mineral density，BMD)顯著增加，完全不受骨量丟失的影響。進一步研究認為羅伊氏乳桿菌對骨的保護作用是由于其抑制破骨細胞中mRNA水平下降，進而減少RANKL和TRAP5的表達實現的。可見益生菌可以防治OP，同時在骨代謝基因轉錄后表達環節進行調控。Collins 等[20]發現羅伊氏乳桿菌6475能夠系統性地抑制腸道和骨髓中促炎細胞因子和促破骨細胞因子的基因表達，減輕腸道炎癥，進而促進鈣通過腸道屏障的轉運。Campbell 等[21]發現雙歧桿菌屬細菌通過產生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFAs)，可降低腸道pH值，進而增加礦物質的吸收，防治OP。此外，雙歧桿菌被證明還能通過減少氧化應激進而減少NF-κB基因表達，預防雌激素缺乏大鼠骨質流失[22]。可見益生菌可以通過調節宿主腸道黏膜免疫細胞中炎癥因子轉錄后表達水平，進而改善離子通道通透性干預OP。總之，益生菌可能通過調節基因轉錄后表達，減輕腸道炎癥，改善離子通道狀態，最終實現預防骨量丟失作用。

4 GM和miRNA相互作用關系

有研究發現，無菌(germ-free，GF)小鼠和無特定病原體(specific pathogen free，SPF)小鼠的盲腸組織中有16個miRNA表達存在差異[23]，將SPF級小鼠糞便中提取出的GM移植入無菌小鼠腸道后，可以觀察到無菌小鼠的回腸和結腸內有9個miRNA的表達發生了顯著變化，進而導致其下游目的基因調控產物發生變化，而這些目的基因的表達產物與腸道屏障和免疫調節功能有關[24]。可見GM可以調節腸上皮細胞、腸黏膜免疫細胞內miRNA水平，最終改變腸上皮通透性和黏膜免疫狀態。為研究miRNA是否參與了微生物介導的宿主基因表達調控，Dalmasso等[24]使用GF小鼠與SPF小鼠的微菌群進行克隆，通過DNA微陣列基因表達譜分析，發現miR-665的上調導致ATP binding cassette subfamily C member3 (Abcc3)基因顯著下調。可見GM可以通過調節miRNA水平進而影響宿主靶基因轉錄后表達。

目前國內外研究主要關注于GM與OP、miRNA與OP，但關于GM調節腸道miRNA治療OP 鮮有報道。雖然目前尚未有報道明確提出腸道內具有調節OP的miRNA，但是已有明確報道通過調節GM可以調節腸道miRNA表達，進而緩解炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，而IBD與OP有著密切的關系。因此通過上述分析我們有理由提出GM很可能通過調節腸上皮細胞、黏膜免疫細胞內miRNA，進而調控與腸道屏障通透性、黏膜免疫狀態相關靶基因表達，最終治療OP。

5 IBD與OP

隨著人們認識深入，OP已被描述為慢性炎癥性疾病。患有IBD、類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、脊椎關節炎、慢性阻塞性肺病等全身炎性免疫變態疾病的患者大多都長期接受糖皮質激素治療，而糖皮質激素對骨骼有有害影響。炎癥本身是造成OP的另一個主要決定因素[25]。Ashcroft等[26]發現白介素2(IL-2)缺乏的小鼠自體免疫模型中，小鼠骨量減少與CD4自身反應性T細胞的去調節和過度活化密切相關。NF-κB受體激活劑配體(RANKL)的增加可導致骨量丟失，通過調節RANKL-RANK與外源性重組骨保護蛋白(Fc-OPG)的相互作用，可以逆轉骨骼異常。可以看出，IBD患者由于GM失調促發腸道炎癥免疫變態反應，是OP發生的中心環節。因此，控制腸道炎癥狀態使IBD減輕，是治療IBD所致OP的關鍵。

5.1GM通過調節腸道miRNA緩解IBD，間接治療OP

Lindsa等[27]借助超高通量測序技術對小鼠模型空腸和結腸黏膜的miRNA進行了定量測定，發現Dicer敲除小鼠中有許多腸屏障基因在轉錄后受到調控，它們可能依賴于miRNA。Xue等[28]觀察發現在SPF小鼠，腸道微生物群抑制宿主腸道上皮細胞和樹突狀細胞(dendritic cell，DC)中miR-10a的表達，有助于維持腸道免疫穩態。Xue等[29]在另一個大腸桿菌感染的小鼠模型腸道中，發現miR-107在上皮細胞和CD11c+髓樣細胞(包括炎癥腸道中的樹突狀細胞和巨噬細胞)中顯著降低，從而下調IL - 6、IFN-γ、TNF-α。結合前面所述GM對于腸道miRNA有調控作用，我們有理由推測GM可以通過調節腸道與IBD相關的miRNA表達水平，進而調控腸上皮屏障功能及腸黏膜免疫狀態緩解IBD，最終減輕由IBD導致的OP。

5.2GM通過調節腸道miRNA直接治療OP

IBD和OP具有相同的miRNA作為宿主基因調控的中介，調控腸道通透性、免疫變態反應及成骨細胞和破骨細胞的活性。Xue等[29]研究發現，miR-10a在GF小鼠腸道內高表達，但在脾臟中表達水平很低，說明miR-10a主要在腸道內表達。結腸炎小鼠炎癥性腸組織表達低水平miR-10a和高水平IL-12/IL-23p40。微生物群通過TLR-TLR配體相互作用，以myd88依賴的方式下調DC中 miR-10a的表達，促使DC產生大量IL-12/IL-23p40，大量炎癥因子激發IBD的發生，從而腸道內穩態被破壞。Hou等[30]使用miR-10a 轉染小鼠成骨細胞前細胞系MC3T3-E1a，研究發現miR-10a 可以阻遏Wnt /β-catenin 信號通路。Wnt /β-catenin 信號通路在成骨細胞的增殖、分化以及骨組織的再生中起著重要作用，該通路的激活可以促進骨組織的再生。Koukos等[31]發現miR-124在潰瘍性結腸炎(UC)患者結腸組織中特異性下調，直接靶向結腸組織中STAT3磷酸化水平升高。Xue等[29]發現在關節炎的小鼠模型中，用 pre-miR-124治療，可使破骨細胞的數量明顯減少。NFATc1 是破骨細胞分化的一個關鍵因素，miR-124 能夠直接作用于 NFATc1，抑制破骨細胞的分化，緩解關節炎的發展。可以看出腸道中也具有與骨代謝調控有關的miRNA，結合前面所述GM對于腸道miRNA有調控作用，我們有理由推測GM通過調節腸道與骨代謝相關的miRNA治療OP。

綜合以上所述，GM一方面可以通過調節腸道IBD相關miRNA減輕腸道炎癥，緩解IBD進而間接治療OP；另一方面可以直接調節腸道高表達的與OP和IBD同時相關的miRNA直接治療OP。通過檢測靶向調節腸道免疫應答途徑中的關鍵信號分子；腸黏膜及上皮屏障功能；腸道炎癥因子水平[32]可以判斷GM究竟是通過調節腸道miRNA減輕腸道炎癥狀態間接治療OP，還是通過直接調節腸道高表達的與OP和IBD同時相關的miRNA直接治療OP。

6 總結與展望

總之，目前研究尚局限于GM干預OP、miRNA干預OP，很少關注GM可能通過調節腸道內miRNA治療OP。通過分析可以看出GM可能通過調節腸道內miRNA水平影響宿主腸道基因轉錄后產物，進而影響腸上皮通道和腸黏膜免疫應答，最終達到治療OP的目的。雖然目前尚無法得知究竟是哪種GM甚至是益生菌可以靶向調控腸道miRNA水平的變化，也無法得知具體參與該過程的腸道miRNA，但隨著腸道菌群檢測技術和高通量測序技術的發展，這一切將變的可行，或許能夠為OP 的預防和治療提供新的思路。