長鏈非編碼RNA MEG3靶向下調(diào)miR-21對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響

丁童 周彥鵬 馮立平

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院創(chuàng)傷外科，河南 新鄉(xiāng) 453003

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是現(xiàn)代社會經(jīng)常發(fā)生的一種關(guān)節(jié)疾病，隨著人類平均壽命逐漸增長，OA的發(fā)病率也如同預(yù)期的一樣不斷增加。OA常常會有關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、骨間摩擦加重、僵硬、關(guān)節(jié)積液以及行動能力喪失等癥狀，并伴隨有不同程度的炎癥發(fā)生[1]。關(guān)節(jié)軟骨進行性破壞、滑膜炎、軟骨硬化及骨質(zhì)增生是導(dǎo)致OA關(guān)節(jié)疼痛及行動力損壞的主要原因[2]。在OA炎癥發(fā)展過程中，白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，可促進基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達、炎癥介質(zhì)PGE2及NO水平升高，引發(fā)炎癥反應(yīng)[3]，IL-1β常被用于OA體外模型的建立。目前對OA的治療手段主要有物理治療、藥物治療和手術(shù)治療等，僅僅能起到緩解關(guān)節(jié)炎癥狀，不能夠有效的根治，并且現(xiàn)有的治療方式還會受到不良反應(yīng)的限制[4]。因此需要尋找更有效的治療方式，從根本上阻止OA的發(fā)生。

MicroRNA(miRNA)是近年來的研究熱點之一，作為一類長度約22 nt的內(nèi)源單鏈非編碼RNA，可與目的mRNA非翻譯區(qū)結(jié)合，調(diào)控基因的表達。miRNA廣泛參與了人類疾病的調(diào)控，在OA中也起著重要的調(diào)控作用[5]。已有研究[6]報道m(xù)iR-21在軟骨細胞中可調(diào)控OA的發(fā)展，而單miRNA往往可能對多個靶基因都存在調(diào)控機制，因此miR-21可能還存在其他機制參與調(diào)控OA[7]。本研究通過培養(yǎng)人關(guān)節(jié)軟骨細胞株CH8，IL-1β處理建立OA體外模型，再通過miR-21 mimic和母系表達基因3(maternally expressed gene 3, MEG3)過表達慢病毒處理，初步探究了miR-21在OA軟骨細胞中與MEG3的作用關(guān)系及調(diào)控機制。

1 材料和方法

1.1主要試劑

DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司，IL-1β購自南京金斯瑞生物科技公司，lipofectamine2000購自Invitrogen公司，QuantNova SYBR Green PCR 試劑盒購自德國Qiagen公司，Hoechst染色試劑、RIPA裂解液、Trizol試劑購自北京索萊寶生物公司，丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase, SOD)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)檢測試劑盒及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)、白細胞介素10(interleukin-10, IL-10)ELISA試劑盒購自南京建成生物科技公司，miR-21 mimic、重組慢病毒顆粒購自上海吉瑪公司，活化半胱天冬酶3(cleave Caspase-3)、活化半胱天冬酶9(cleave Caspase-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13, MMP-13)、II型膠原蛋白(Collagen II)、聚蛋白聚糖(Aggrecan)、p65、p-p65、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)、p-STAT3抗體購自美國Santa Cruz公司，實驗所用引物采用Primer3 input設(shè)計，上海生工生物公司合成。

1.2細胞培養(yǎng)

人關(guān)節(jié)軟骨細胞株CH8購自ATCC公司，細胞在37 ℃ 5 % CO2的環(huán)境下培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，隔天換液1次，2～3 d根據(jù)細胞生長情況換液。

1.3細胞分組及處理方法

將細胞分為空白對照(cTRL)組、IL-1β組、LV-MEG3組、miR-21 mimic組和LV-MEG3+mimic組，除cTRL組外，每組分為加入10 ng/mL的IL-1β處理2 h，MEG3重組慢病毒顆粒分別感染LV-MEG3和LV-MEG3+mimic組細胞，按照lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，使用miR-21分別轉(zhuǎn)染miR-21 mimic組和LV-MEG3+mimic組。

1.4病毒感染CH8軟骨細胞株

將處理對數(shù)生長期的CH8細胞接種于6孔板，每孔5×104個，當(dāng)細胞生長融合至70%匯合后，1×108TU/mL MEG3重組慢病毒液每孔加入10 μL感染細胞，24 h后完全培養(yǎng)液37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.5RT-PCR檢測mRNA表達水平

根據(jù)1.3的方法分組處理細胞后，用Trizol提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后按照QuantNova SYBR Green PCR kit說明書進行PCR反應(yīng)，條件設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s，退火/延伸60 ℃ 10 s，40個循環(huán)。2-ΔΔCt法進行計算表達水平。

1.6Hoeschst檢測細胞凋亡

根據(jù)1.3的方法分組處理細胞后，接種于6孔板，多聚甲醛固定細胞，并使用0.5 % TrintonX-100進行透膜處理，Hoeschst熒光染料室溫染色30 min，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，以核固縮，細胞核致密濃染視為細胞凋亡，細胞凋亡率=凋亡細胞/細胞總數(shù)×100%。

1.7Western blot檢測蛋白表達

根據(jù)1.3的方法分組處理細胞后，RIPA裂解液提取各組總蛋白，BCA定量，10% SDS-PAGE分離各組蛋白，點樣孔每孔30 μg，分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5 % 脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次后使用二抗孵育2 h，Ecl顯色，GAPDH作為內(nèi)參。

1.8MDA、SOD、LDH、GSH水平檢測

根據(jù)1.3的方法分組處理細胞后，硫代巴比妥法(TBA)檢測細胞培養(yǎng)液中MDA含量，羥胺法檢測細胞培養(yǎng)液中SOD活力，比色法檢測細胞培養(yǎng)液中LDH活力，比色法檢測細胞培養(yǎng)液中GSH含量，所有操作按試劑盒說明書進行。

1.9ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-10水平

根據(jù)1.3的方法分組處理細胞后，采用ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6、IL-10水平，所有操作按試劑盒說明書進行。

1.10免疫熒光檢測核定位水平

根據(jù)1.3的方法分組處理細胞后，多聚甲醛固定細胞，TrintonX-100透膜處理，14 min后使用PBS緩沖液清洗3次，10 %封閉山羊血清室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜。清洗后滴加FITC標(biāo)記的熒光二抗室溫避光孵育1 h，DAPI即用液避光孵育15 min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡觀察p65的核定位情況。

1.11統(tǒng)計學(xué)處理

用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0處理實驗數(shù)據(jù)，組間采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析比較數(shù)據(jù)，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示實驗結(jié)果，當(dāng)P<0.05，認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1OA軟骨細胞中MEG3表達與miR-21表達存在相互作用關(guān)系

如圖1所示，與cTRL組比較，IL-1β組MEG3表達水平顯著降低(圖1 A)，miR-21表達水平顯著升高(圖1B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與IL-1β組比較，LV-MEG3組MEG3表達水平顯著升高(圖1 A)，miR-21表達水平顯著降低(圖1B)，miR-21 mimic組MEG3表達水平顯著降低(圖1 A)，miR-21表達水平顯著升高(圖1B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與miR-21 mimic組比較，LV-MEG3+mimic組MEG3表達水平顯著升高(圖1 A)，miR-21表達水平顯著降低(圖1B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2OA軟骨細胞中miR-21和MEG3表達對細胞凋亡的影響

如圖2所示，與cTRL組比較，IL-1β組細胞凋亡比率顯著升高(圖2B)，cl-Caspase-3和cl-Caspase-9蛋白表達水平升高(圖2C)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與IL-1β組比較，LV-MEG3組細胞凋亡比率顯著降低(圖2B)， cl-Caspase-3和cl-Caspase-9蛋白表達水平降低(圖2C)，miR-21 mimic組細胞凋亡比率顯著升高(圖2B)，cl-Caspase-3和cl-Caspase-9蛋白表達水平升高(圖2C)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與miR-21 mimic組比較，細胞凋亡比率顯著降低(圖2B)，cl-Caspase-3和cl-Caspase-9蛋白表達水平降低(圖2C)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3OA軟骨細胞中miR-21和MEG3表達對細胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達的影響

圖1 OA軟骨細胞中MEG3與miR-21的基因表達注：A：OA軟骨細胞中MEG3的相對表達； B：OA軟骨細胞中miR-21的相對表達；1：cTRL組；2：IL-1β組；3：LV-MEG3組；4：miR-21 mimic組；5：LV-MEG3+mimic組。Fig.1 The expressions of MEG3 and miR-21 in OA chondrocytesA, The relative expression of MEG2 in OA chondrocytes; B, the relative expression of miR-21 in OA chondrocytes. 1, cTRL group; 2, IL-1β group; 3, LV-MEG3 group; 4, miR-21 mimic group; 5, V-MEG3+mimic group.

圖2 miR-21和MEG3對OA軟骨細胞凋亡的影響(200×)注：A：Hoeschst檢測細胞凋亡；B：OA軟骨細胞凋亡率；C：Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白cl-Caspase-3和cl-Caspase-9相對表達水平；1：cTRL組；2：IL-1β組；3：LV-MEG3組；4：miR-21 mimic組；5：LV-MEG3+mimic組。Fig.2 The effects of miR-21 and MEG3 on cell apoptosis of OA chondrocytesA, Cell apoptosis detected with Hoeschst staining; B, apoptosis rate of OA chondrocytes; C, the relative expression of apoptosis-related proteins cl-Caspase-3 and cl-Caspase-9 detected with Western blotting. 1, cTRL group; 2, IL-1β group; 3, LV-MEG3 group; 4, miR-21 mimic group; 5, V-MEG3+mimic group.

如圖3所示，與cTRL組比較，IL-1β組MMP-13基因和蛋白表達水平顯著升高(圖3 A，C)，Collagen II和Aggrecan基因和蛋白表達水平顯著降低(圖3 A，C)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與IL-1β組比較，LV-MEG3組MMP-13基因和蛋白表達水平顯著降低(圖3 A，C)，Collagen II和Aggrecan基因和蛋白表達水平顯著升高(圖3 A，C)，miR-21 mimic組MMP-13基因和蛋白表達水平顯著升高(圖3 A，C)，Collagen II和Aggrecan基因和蛋白表達水平顯著降低(圖3 A，C)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與miR-21 mimic組比較，LV-MEG3+mimic組MMP-13基因和蛋白表達水平顯著降低(圖3 A，C)，Collagen II和Aggrecan基因和蛋白表達水平升高(圖3 A，C)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 miR-21和MEG3對OA軟骨細胞MMP-13、Collagen II和Aggrecan基因和蛋白表達的影響注：A：MMP-13、Collagen II、Aggrecan相對mRNA表達水平；B：Western blot檢測MMP-13、Collagen II、Aggrecan蛋白表達；C：MMP-13、Collagen II、Aggrecan相對蛋白表達水平；1：cTRL組；2：IL-1β組；3：LV-MEG3組；4：miR-21 mimic組；5：LV-MEG3+mimic組。Fig.3 The effects of miR-21 and MEG3 on MMP13, collagen II, and Aggrecan genes and proteins in OA chondrocytesA, The relative mRNA expression levels of MMP-13, collagen II and Aggrecan; B, the protein expression of MMP-13, collagen II, and Aggrecan detected with Western blotting, C, the relative protein expression of MMP-13, collagen II, and Aggrecan. 1, cTRL group; 2, IL-1β group; 3, LV-MEG3 group; 4, miR-21 mimic group; 5, V-MEG3+mimic group.

2.4miR-21和MEG3表達影響OA軟骨細胞的氧化應(yīng)激

如圖4所示，與cTRL組比較，IL-1β組MDA、LDH水平顯著升高(圖4 A，B)，SOD和GSH水平顯著降低(圖4C，D)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與IL-1β組比較，LV-MEG3組MDA和LDH水平顯著降低(圖4 A，B)，SOD和GSH水平顯著升高(圖4C，D)，miR-21 mimic組MDA和LDH水平升高(圖4 A，B)，SOD和GSH水平降低(圖4C，D)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與miR-21 mimic組比較，LV-MEG3+mimic組MDA和LDH水平顯著降低(圖4 A，B)，SOD和GSH水平顯著升高(圖4C，D)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 miR-21和MEG3對OA軟骨細胞MDA、LDH、SOD和GSH水平的影響注：A：MDA水平檢測；B：LDH水平檢測；C：SOD水平檢測；D：GSH水平檢測；1：cTRL組；2：IL-1β組；3：LV-MEG3組；4：miR-21 mimic組；5：LV-MEG3+mimic組。Fig.4 The effects of miR-21 and MEG3 on the levels of MDA, LDH, SOD, and GSH in OA chondrocytesA, MDA level; B, LDH level; C, SOD level; D, GSH level. 1, cTRL group; 2, IL-1β group; 3, LV-MEG3 group; 4, miR-21 mimic group; 5, V-MEG3+mimic group.

2.5OA軟骨細胞中miR-21和MEG3對炎癥細胞因子的影響

如圖5所示，與cTRL組比較，IL-1β組TNF-α和IL-6水平顯著升高，IL-10水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與IL-1β比較，LV-MEG3組TNF-α和IL-6水平顯著降低，IL-10水平顯著升高，miR-21 mimic組TNF-α和IL-6水平升高，IL-10水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與miR-21 mimic組比較，LV-MEG3+mimic組TNF-α、IL-6水平顯著降低，IL-10水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.6OA軟骨細胞中miR-21和MEG3對NF-κB信號通路的影響

如圖6所示，與cTRL組比較，IL-1β組p65和STAT3磷酸化比率顯著升高(圖6 A)，細胞核內(nèi)p65信號水平顯著升高(圖6B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與IL-1β組比較，LV-MEG3組p65和STAT3磷酸化比率顯著降低(圖6 A)，細胞核內(nèi)p65信號水平顯著降低(圖6B)，miR-21 mimic組p65和STAT3磷酸化比率顯著升高(圖6 A)，細胞核內(nèi)p65信號水平顯著升高(圖6B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與miR-21 mimic組比較，MEG3+mimic組p65和STAT3磷酸化比率顯著降低(圖6 A)，細胞核內(nèi)p65信號水平顯著降低(圖6B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 miR-21和MEG3對OA軟骨細胞TNF-α、IL-6和IL-10的水平影響Fig.5 The effects of miR-21 and MEG3 on the levels of TNF-α, IL-6, and IL-10 in OA chondrocytes**P<0.01 versus cTRL group; ##P<0.01 versus IL-1β group; &&P<0.01 versus miR-21 mimic group.

圖6 miR-21和MEG3對OA軟骨細胞p65、STAT3磷酸化的影響及p65在細胞核內(nèi)的表達(400×)注：A：Western blot檢測p-P65/P65和p-STAT3/STAT3蛋白表達比率；B：p65在細胞核內(nèi)的表達；1：cTRL組；2：IL-1β組；3：LV-MEG3組；4：miR-21 mimic組；5：LV-MEG3+mimic組Fig.6 The effects of miR-21 and MEG3 on phosphorylation of p65 and STAT3 in OA chondrocytes and the expression of p65 in the cell nuclearA, The relative protein expression rate of p-P65/P65 and p-STAT3/STAT3 detected with Western blotting; B, the expression of p65 in the cell nuclear. 1, cTRL group; 2, IL-1β group; 3, LV-MEG3 group; 4, miR-21 mimic group; 5, V-MEG3+mimic group.

3 討論

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度大于200 nt的非編碼RNA[8]，有著復(fù)雜的作用機制，可通過基因印記、染色質(zhì)重塑、細胞周期調(diào)控、剪接調(diào)控、mRNA降解和翻譯調(diào)控等方法調(diào)控各種生物學(xué)進程[9]。其中MEG3因與腫瘤的密切聯(lián)系而受到研究者的廣泛關(guān)注[10]，Zhu等[11]的研究表明，MEG3過表達可通過下調(diào)miR-21抑制乳腺癌腫瘤的形成，熒光素酶報告檢測結(jié)果表明，MEG3和miR-21存在直接的靶向關(guān)系。而在正常及疾病組織中，MEG3與miR-21的靶向關(guān)系可能發(fā)揮著截然不同的調(diào)控作用。Su等[12]的研究表明，在OA組織中，MEG3表達水平下調(diào)；Xu等[13]的研究表明，MEG3下調(diào)將會導(dǎo)致OA發(fā)展，作用機制是與miR-16/SMAD7有關(guān)。同時，Zhang等[6]的研究報道了miR-21在軟骨細胞中的上調(diào)可通過靶向作用于GDF-5促進OA的發(fā)展，因此，在OA軟骨細胞中，MEG3和miR-21之間可能存在著相互作用調(diào)控OA的機制。

為了證實這一推測，本研究首先檢測了MEG3和miR-21的基因表達水平，發(fā)現(xiàn)在IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細胞中，MEG3顯著降低，miR-21顯著升高，并且MEG3可顯著抑制miR-21的表達，表明在OA軟骨細胞中MEG3可靶向下調(diào)miR-21的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MEG3過表達可顯著抑制IL-1β引起的細胞凋亡，miR-21可顯著提高細胞凋亡，而MEG3可顯著緩解miR-21過表達引起的細胞凋亡，表明MEG3可通過下調(diào)miR-21抑制OA軟骨細胞凋亡；同時，在分子水平上，MEG3過表達顯著抑制了cl-Caspase-3和cl-Caspase-9的蛋白表達，miR-21過表達則可顯著提高cl-Caspase-3和cl-Caspase-9的蛋白表達，并且MEG3可顯著抑制miR-21過表達引起的cl-Caspase-3和cl-Caspase-9蛋白表達提升。cl-Caspase-3和cl-Caspase-9同屬于半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)家族，cl-Caspase-3細胞凋亡的執(zhí)行因子，表達水平上調(diào)與細胞凋亡緊密關(guān)聯(lián)[14]。cl-Caspase-9參與了內(nèi)源凋亡途徑的起始，作用方式是裂解激活下游的執(zhí)行因子，其中cl-Caspase-3的酶原是cl-Caspase-9的主要底物之一[15]。結(jié)合實驗結(jié)果表明，MEG3可通過下調(diào)miR-21，抑制OA軟骨細胞凋亡，其作用機制與內(nèi)源凋亡途徑相關(guān)。

軟骨細胞外基質(zhì)降解對于OA的發(fā)展起著重要作用，Collagen II和Aggrecan是構(gòu)成軟骨細胞基質(zhì)的主要成分，和軟骨細胞存在大量的信息、物質(zhì)和能量交流，細胞外基質(zhì)發(fā)生降解是導(dǎo)致軟骨細胞壞死，功能喪失的重要原因[16]，MMP-13屬于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族，能降解多種膠原蛋白，在軟骨細胞中，其最主要的底物是Collagen II，是OA中研究較多的膠原酶指標(biāo)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)， MEG3過表達顯著抑制了IL-1β誘導(dǎo)的MMP-13的表達上調(diào)，并促進Collagen和Aggrecan表達，miR-21則具有相反的調(diào)控作用，MEG3可顯著抑制miR-21對MMP13的上調(diào)和對Collagen II、Aggrecan的下調(diào)，表明MEG3可通過下調(diào)miR-21，抑制OA軟骨細胞外的基質(zhì)降解。

氧化應(yīng)激參與了OA的發(fā)展，活性氧(reactive oxygen species, ROS)在正常關(guān)節(jié)中具有重要的生理功能，并與SOD、GSH的清除作用達成動態(tài)平衡，在OA患者體內(nèi)活性氧含量增加，造成關(guān)節(jié)軟骨的破壞[18]，MDA是脂膜氧化的終產(chǎn)物[19]，LDH存在于各組織器官中，當(dāng)軟骨細胞膜損傷時表現(xiàn)為活性升高[20]，MDA、LDH、SOD、GSH均是測定氧化應(yīng)激的可用指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)MEG3過表達可顯著抑制OA軟骨細胞氧化應(yīng)激的水平，miR-21加重氧化應(yīng)激的水平，MEG3可緩解miR-21對氧化應(yīng)激的上調(diào)，表明MEG3可通過下調(diào)miR-21，緩解氧化應(yīng)激對OA軟骨細胞的損壞。

炎癥在OA發(fā)展中起著重要作用，TNF-α、IL-6、IL-1β均是參與OA炎癥發(fā)生的重要促炎細胞因子[21]，TNF-α可與IL-1β協(xié)同作用，促進軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞[22]，TNF-α還可誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生，進一步加重對關(guān)節(jié)軟骨的破壞。TNF-α與IL-6表達與OA炎癥嚴重程度呈正相關(guān)[23]。IL-10為OA炎癥中的抗炎細胞因子，可抑制TNF-α和IL-1等促炎細胞因子的合成，保護軟骨細胞[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，MEG3過表達可抑制IL-1β誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6水平升高及IL-10水平降低，miR-21過表達的作用正好相反，MEG3可抑制miR-21引起的TNF-α、IL-6水平升高和IL-10水平降低，表明MEG3可通過下調(diào)miR-21，緩解OA的炎癥反應(yīng)。

核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear factor-kappa B, NF-κB)和信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)信號通路在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的調(diào)控中起著重要作用[25-26]。NF-κB與包括OA在內(nèi)的諸多疾病的氧化應(yīng)激和炎癥細胞因子有著密切聯(lián)系，Zuo等[27-28]研究表明，馬尾藻可通過下調(diào)包括NF-κB在內(nèi)的一系列信號通路，減輕IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細胞中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。在NF-κB信號通路中，p65是NF-κB家族最常見的成員之一，通常與p50形成二聚體，當(dāng)誘導(dǎo)物如TNF-α激活其上游通路后，二聚體活化轉(zhuǎn)運進入細胞核參與基因表達調(diào)控，STAT3是STAT家族的一員，當(dāng)誘導(dǎo)物如IL-6激活上游通路后，STAT3發(fā)生磷酸化形成二聚體，進入核內(nèi)調(diào)控基因表達。本研究發(fā)現(xiàn)MEG3過表達可抑制IL-1β誘導(dǎo)的p65和STAT3活化水平升高，降低p65核定位水平，miR-21可提升IL-1β誘導(dǎo)的p65和STAT3活化并促進p65入核，MEG3可抑制miR-21的作用，表明MEG3可通過下調(diào)miR-21，抑制NF-κB和STAT3信號通路的激活。

綜上所述，MEG3可通過與miR-21靶向作用，下調(diào)miR-21在OA軟骨細胞當(dāng)中的表達水平，進而抑制IL-1β誘導(dǎo)的細胞凋亡，降低軟骨細胞外基質(zhì)的降解水平，抑制IL-1β誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，緩解炎癥反應(yīng)，其作用機制可能與抑制NF-κB和STAT3信號通路的激活有關(guān)。本研究首次探究了MEG3可通過靶向下調(diào)miR-21表達，抑制IL-1β誘導(dǎo)的細胞凋亡及炎癥反應(yīng)，并初步探究了其作用機制，可能為OA治療提供了新的靶向治療思路和診斷標(biāo)志物。后期將重點對MEG3對OA其他作用機制進行進一步探究。