成血管-成骨耦聯相關因子、細胞在骨中作用機制的研究進展

申震 姜自偉 陳國茜 李定 張嚴 李紫閣 黃楓

1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院骨傷科，廣東 廣州 510405

骨是一種高度血管化的組織，在整個機體生命周期中經歷著持續的吸收和重建過程，而在此過程中血管內皮細胞(endothelial cells，ECs)和骨細胞之間在空間和時間上密切連接以保持骨骼的完整性[1]。血管生成是各類器官發生中最早的事件之一[2]，骨血管系統在骨骼發育、重塑以及維持骨量平衡中均起著重要作用[3-8]。在骨生長發育和修復期間，新血管生成是重要的環節，二者都涉及血管生成和骨生成信號途徑之間的激活和復雜的相互作用，而血管生成發生在骨生成之前[9]，且新生血管可確保循環成骨細胞前體和破骨細胞轉運至特定部位[10]。這說明骨生成是一個血管依賴性過程，血管生成與骨生成空間和時間上密切的關系被稱為“成血管-成骨耦聯”作用[3,11-12]。近年來隨著科學技術的發展，研究發現骨內微小血管生成和骨內微環境在成骨和骨量維持等方面同樣扮演著重要角色[13]。據報道[14]，骨內還存在兩種具有不同形態、功能和空間分布的特異性血管ECs亞型，即對血小板內皮細胞粘附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31/PECAM-1)和內皮粘蛋白(endomucin，Emcn)高表達的H型ECs(CD31hiEmcnhi)以及對CD31和Emcn低表達的L型ECs(CD31loEmcnlo)。其中H型ECs在介導血管生成和骨生成耦聯過程中起著重要作用，H型血管不僅可向骨組織供應營養物質、生長因子、激素、趨化因子和細胞因子以及傳輸代謝廢物，還充當了骨骼和鄰近組織之間的交流網絡[15]，由H型血管釋放的血管分泌因子傳遞信號調控著骨生長和骨穩態，并進一步增強血管生成和骨生成間的相互聯系[14，16]。這不僅豐富了血管與骨相互作用間的內容，還為探究成血管-成骨耦聯機制提供了新的研究方向。故本文就成血管-成骨耦聯相關因子、細胞及機制在骨中所起的作用進行綜述。

1 成血管-成骨耦聯調節因子

1.1 血管內皮生長因子

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前研究最多且是已知的誘導血管生成最強的一種細胞因子，是促進血管生成相關的分子和細胞級聯反應中的關鍵調節劑[17]。雖然VEGF主要作用于ECs，但也可與成骨細胞等其他類型細胞上的VEGF受體相結合[18-19]，最終通過血管發生、血管生成或淋巴管系統形成等形式促進血管系統的發育[20-21]。然而，VEGF不僅對血管生成具有重要作用，在骨生長發育過程中同樣扮演重要角色[22-23]。一方面VEGF自身就具有促進成骨的能力，既能調節成骨細胞的趨化性、增殖和分化，調控成骨細胞的活性從而對成骨產生直接作用[24]；另一方面又能調節間充質細胞向成骨細胞分化，或通過血管生長機制刺激ECs產生成骨細胞因子，促進祖細胞向成骨細胞分化而發揮間接作用[25]。Geiger等[24]發現處于生長階段長骨中的血管尚未完全形成之前均能檢測到VEGF的表達，并且該表達與骨生成過程有關。與此同時，VEGF還具有趨化作用可使骨髓間充質干細胞向骨缺損區域富集，通過促進血管生成、軟骨吸收以及軟骨內成骨的分化來促進新骨生成。而當抑制VEGF表達或VEGF表達降低時，則會導致成骨障礙或骨量丟失。VEGF及其相關血管對骨生成發揮重要作用，但血管網絡的生長又受成骨細胞所提供的信號調控[14]。VEGF通過直接或間接作用于成骨細胞促進骨的生長發育，而成骨細胞又能分泌VEGF等因子反作用調控血管生成[26]。Huang等[27]在小鼠及體外細胞實驗中證實了成骨細胞尚能分泌趨化因子Cxcl-9(C-X-C motif ligand- 9)調節血管生成，Cxcl-9能與VEGF相互作用并阻止其與VEGF受體結合，繼而阻止VEGF與ECs和成骨細胞結合，從而抑制血管生成和骨生成。因此，減少骨內 Cxcl-9 含量，增加骨內血管生成，從而為骨生成和再生提供了新的作用靶點。而VEGF與成骨細胞間的相關作用也正是成血管-成骨耦聯作用的一種體現。

1.2 血小板衍生生長因子-BB

血小板衍生生長因子-BB(platelet-derived growth factor，PDGF-BB)在骨生成過程中由脫顆粒化血小板釋放。據報道[28]，PDGF-BB既能通過上調VEGF而刺激血管生成，又可通過對成骨細胞施加趨化性和促有絲分裂信號促進成骨。Xie等[29]在研究中發現位于骨膜處的破骨前體細胞可分泌PDGF-BB，一方面PDGF-BB可刺激內皮祖細胞和MSCs的遷移，并促進血管生成[30]。另一方面PDGF-BB被認為是能夠調動間充質來源細胞，穩定新生血管并協調成骨細胞分化的細胞成分[31]。除此之外，PDGF-BB可誘導H型血管生成以促進血管生成與骨生成之間的耦聯作用[29]。研究發現，在骨膜骨中PDGF-BB誘導H型血管生成并刺激1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1 phosphoric acid，S1P)分泌以促進成骨細胞分化，繼而促進新骨生成；在骨小梁重塑過程中，PDGF-BB同樣誘導生成H型血管，但在骨重塑期間主要發揮物質傳輸作用。

1.3 轉化生長因子-β

轉化生長因子-β(transforming growth factor -β，TGF-β)是一種多效能生長因子，具有促進細胞增殖、調節細胞分化、調控細胞周期及誘導細胞凋亡等作用，同時可刺激細胞外基質分泌與沉積，在骨生成與血管生成方面扮演重要角色[32]。Tang等[33]首先證實了TGF-β是一種重要的趨化募集因子，參與MSCs的募集和增殖，不僅可調節成骨細胞分化，還可促進成骨細胞前體向骨重塑部位轉移。與此同時，TGF-β促進成骨細胞的新陳代謝和細胞外基質的合成，通過抑制破骨細胞的生成和成熟破骨細胞的活性，實現抑制骨吸收和促進成骨的目的。除了在成骨方面的重要作用，TGF-β還可調節造血細胞和血管ECs中VEGF的表達，從而在成骨過程中對血管化進程產生積極影響，繼而加強血管生成與骨生成之間的耦聯關系[34]。

1.4 低氧誘導轉錄因子-1α

低氧誘導轉錄因子-1α(hypoxia-inducible transcription factor-1α，HIF-1α)是成血管-成骨級聯反應啟動所必需的因素，是協調成血管-成骨耦聯基因程序的主要調節物。當局部缺血、缺氧時，HIF-1α、VEGF、PDGF-BB等促血管生成因子表達以激活ECs[35]。與此同時，缺氧細胞向血管元件發出信號，以確保發育中血管系統的適當分化。成骨細胞、骨細胞和ECs含有必需的細胞元件以感知和響應組織中氧氣張力的變化，并在時間和空間上協調骨生成[1]。在軟骨內化骨過程中，軟骨內骨生長板的間充質濃縮階段即是缺氧狀態并且表達HIF-1α[36]，而HIF-1α的缺失可導致肥大軟骨細胞VEGF表達下降，這表明肥大軟骨細胞產生VEGF也可能受HIF-1α機制的調控。此外，HIF-1α刺激微環境中產生VEGF，先是VEGF在軟骨膜中表達，刺激軟骨膜血管發生，隨后在增生性軟骨中VEGF表達升高從而引發血管侵入軟骨，繼而為軟骨內化骨后續過程奠定血運基礎。除此之外，成骨細胞也表達HIF途徑的組分，并在長骨形成過程中促進骨骼血管生成。這些研究表明缺氧是骨生成過程中誘導血管生成的主要驅動力，而HIF-1α轉錄因子和其靶基因VEGF是成血管-成骨耦聯的關鍵調節因子。研究證實HIF-1α對H型ECs誘導起著關鍵作用，通過維持HIF-1α活性可促進H型ECs的生成，并可提高成骨細胞分泌成血管因子的能力從而促進H型血管生成[37]。

2 成血管-成骨耦聯調節細胞

2.1 內皮細胞

血管與骨在物理和生物化學上存在密切聯系，遺傳學、生物化學和藥理學研究已經證實在骨生成和修復期間ECs和成骨細胞存在相互作用。血管生成與骨生成相互耦聯，也表明ECs和成骨細胞之間存在信號調控間的分子串話[38]。而ECs是血管最重要的組成部分之一，在成熟的血管系統中ECs在維持周圍組織的穩態起關鍵作用，既為鄰近組織提供交流網絡，又能在需要時作為屏障來限制分子和細胞的運動[15]。此外，ECs在維持骨穩態方面同樣扮演重要角色，不僅可作為高通透性屏障起作用，還可分泌活性因子促使包括造血細胞在內的循環細胞被募集到骨內。更為重要的是，Maes等[11]發現的高度特異性的H 型ECs在骨局部微環境中可以生成特異性H型血管介導循環細胞，同時促進氧氣、營養物和廢物的傳輸，還能介導成骨細胞、骨細胞、破骨細胞和血管ECs之間的相互作用，釋放血管分泌信號調控成骨作用和骨平衡[39-40]。在成骨過程中，ECs侵入生長板區域的軟骨形成一個用于營養供應的血管通道，并作為新骨形成的支架[41]。新生成血管可確保成骨細胞前體和破骨細胞穩定轉運至重塑部位，有助于進一步促進骨吸收和骨生成。除此之外，ECs易受到低氧、機械或VEGF的影響，在骨修復過程中，由于骨折后血液供應遭到破壞，氧氣供應中斷和周圍組織的急性壞死在受傷的縫隙周圍形成低氧環境，這種缺氧環境誘導成骨細胞產生HIF-1α等調節因子，繼而影響ECs增殖、分化，并誘導ECs分泌成骨生長因子反作用于成骨細胞。血管和骨骼內的ECs還可以調節骨祖細胞轉移到骨折部位促進骨修復，并可促進循環細胞特別是造血細胞對骨髓的調節，將它們定向轉移到骨骼區域。而當ECs功能異常引起骨組織血管供應發生改變時，則會出現骨質疏松癥、骨折延遲愈合甚至骨不連等骨骼病變。

2.2 內皮祖細胞

內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是在骨髓和外周血中循環的另一類細胞群體，具有比成熟的ECs更強的增殖能力。研究發現EPCs能夠在體外培養出EC并促進血管網絡的形成，而EPCs介導的血管形成是骨生成或修復不可或缺的關鍵因素[42]。骨生長發育過程中新血管形成主要通過血管生成和血管發生兩種方式，EPCs對以上兩種方式都有積極作用。其中血管發生是指在沒有預先存在的血管成分情況下，通過局部或循環EPCs的分化發生[43]，這表明EPCs在血管形成中扮演著重要角色。此外，EPCs可通過旁分泌機制誘導骨祖細胞的募集、增殖和分化，并在適當的微環境中轉化為成骨細胞促進成骨作用[44]。Lee等[45]發現在大鼠牽張成骨模型中EPCs移動到缺損愈合部位的現象明顯增加。Atesok等[46]證實EPCs在骨折愈合過程中引發新血管生成和新骨生成，自體EPCs移植可以促進臨界尺寸缺損的血管生成和骨生成。

2.3 壁細胞

壁細胞，即骨內包含的血管周圍間充質細胞群，主要分布在血管周圍，其在調節造血、骨生成和血管穩態中發揮重要的功能作用。在H與L型血管周圍存在著大量的多種類型的壁細胞。其中在干骺端的柱狀H型毛細血管被血小板衍生生長因子受體β(platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β)陽性細胞和神經/膠質抗原-2(neurogia -2，NG-2)細胞包圍，這些壁細胞被H型ECs分泌的PDGF-B所調控[47]，在血細胞生成、骨生成和血管穩態調節中起重要功能作用。而L型竇狀血管則被另外兩種壁細胞包圍，一種是對瘦素受體(leptin receptor，LEPR)表達陽性的LEPR+細胞，另一種是富含CXCL-12的網狀細胞(CXCL-12-abundant reticular，CAR)，但對PDGFR-β和NG2表達呈陰性[48]。研究表明[49]這些壁細胞聚集在H與L型血管周圍，通過分泌CXCL-12、干細胞因子和血管生成素等分子信號增強了成血管與成骨之間的密切聯系和相互作用。

3 成血管-成骨耦聯相互作用

ECs和成骨細胞以及成骨細胞前體空間結構上的緊密聯系，既保證了二者之間進行物質交換，同時也為二者之間進行信號交流、發揮協同作用奠定了基礎。Maes等[38]在由他莫昔芬誘導的轉基因Rosa26R-LacZ受體小鼠實驗中發現成骨細胞前體利用血管作為支持它們遷移的通道并沿著內皮的近腔表面進入骨骼，在遷移過程中血管轉輸而來的營養物質以及活性因子不斷作用成骨細胞前體促進其逐漸向成骨細胞轉化，而成骨細胞以周細胞樣的方式侵入膜內血管并和ECs被吸引到同一個由肥大細胞產生并表達特殊化學引誘物的軟骨，繼而將ECs生成的血管“拉入”到無血管的軟骨中促進軟骨內成骨。最新的兩篇文獻[50-51]也證實了H型血管可增強成血管-成骨耦聯作用，對促進新骨生成以及防治骨質疏松癥具有重要意義。一方面H型血管能夠產生獨特的代謝和分子微環境，既能運送成骨前體細胞至特定位置，又可以釋放血管分泌信號和骨生成分子進行連接，介導成骨細胞系細胞與血管ECs之間的相互作用[14，52]。此外，H型ECs可與骨祖細胞相接觸，富集與骨祖細胞存活和增殖相關的生長因子，維持骨組細胞的數量和活性促進成骨細胞增殖、分化。而另一方面，成骨細胞又是骨中造血微環境中的重要組成部分，Rankin等[53]發現成骨細胞中HIF的失活導致促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)在骨骼中表達降低，而增強HIF活性可上調骨髓中造血干細胞和骨祖細胞的功能活性，通過調節成骨細胞中PHD/VHL/HIF通路可促進EPO分泌和調節紅細胞生成。同時，成骨細胞中過表達HIF可使VEGF含量水平升高并形成血管化極其致密豐富的骨骼，而VEGF等生長因子信號又可以通過PI3K/AKT途徑激活成骨細胞中的HIF活性，繼而促進血管生成和骨生成[54]。除此之外，骨細胞也能產生吸引血管朝向代謝活躍區域發展的局域性生長因子。骨發育過程中肥大軟骨細胞可釋放信號刺激軟骨痂的新血管生成，然后肥大軟骨細胞凋亡，破骨細胞募集引發骨痂重塑及其編織骨被取代，最終被礦化以充分支持骨骼的機械需求。而如果抑制血管生成則會阻礙成骨細胞替代軟骨細胞，在骨折愈合過程中則會出現組織中大量軟骨細胞而非成骨細胞聚積。同理，H型ECs如果生成減少或PDGF-BB分泌下降則會導致骨生成減少而骨吸收增加，骨生成和吸收之間出現紊亂的現象，繼而導致骨量流失、骨礦密度下降、骨質疏松癥等問題[14，29,37]。

4 結語及展望

綜上所述，在骨生長發育及維持骨量平衡過程中，血管與骨之間密切相關，成血管-成骨耦聯涉及諸多生長因子、細胞和調控作用。血管對于骨骼的意義不僅體現在為骨生長和修復發揮氧氣、營養物質、生長因子、代謝廢物的轉輸作用，更為重要的是分泌因子、信號傳遞、功能調控等方面，而成骨細胞、骨細胞等對血管生成具有調節作用。與以往成骨細胞與破骨細胞功能耦聯的二元調控機制相比，血管ECs在其中的協調作用也同樣重要。然而，當前有關成血管-成骨耦聯機制的研究尚不夠深入，尤其是H型ECs在各種生理和病理環境中的具體作用尚未被完全闡明，而了解血管生成和骨生成之間的耦聯關系將為探究骨疾病機理以及指導治療提供新的思路和策略。