EPCs移植對去卵巢大鼠骨質疏松的影響

歐陽利云 唐穎 上官文峰

河南科技大學第三附屬醫院脊柱外科，河南 洛陽 471003

絕經后骨質疏松癥(osteoporosis,OP)的主要特征為全身骨量的逐漸減少，骨組織結構紊亂,骨強度減低，骨的脆性增加，極易發生骨折。其病理機制為骨吸收代謝后，未分化的干細胞不能及時的分化為成骨細胞，導致了骨形成不足[1-3]。近年來對于OP治療方法有眾多的研究，如藥物治療、中醫針灸、中藥治療等，但臨床治療效果仍有待進一步提高。干細胞移植治療為近年來的研究熱點[4-5]，即通過干細胞移植發揮對骨質疏松的治療作用。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一類能夠循環、增殖并有著在特定情況下分化為各種細胞的功能[6-7]。本實驗通過切除雌性大鼠卵巢，降低大鼠雌激素分泌，從而構建絕經后骨質疏松癥大鼠模型，進而通過尾靜脈移植同源異體的EPCs，評估該治療對骨質疏松大鼠TGF-β/Smads通路的影響及治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料及來源

骨密度測定儀器(CHAILENGE雙能X線， 法國 GK 公司);胎牛血清(貨號16000-044);DMEM培養基(貨號11965-092,美國Gibco BRL公司);胰蛋白酶(Amreseo公司);Trizol試劑盒(上海華舜公司);體重計(美國GE公司); BAP酶聯免疫測定試劑盒、 CTX-I檢測試劑盒、 TRAP5b檢測試劑盒(寶生物工程有限公司，大連);TGF-β1、Smad2、Smad3、GAPDH兔抗大鼠多克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG(英國Abcam公司)；胰蛋白酶、RT-PCR試劑盒(碧云天生物技術有限公司);引物(上海生工);大鼠EPCs(武漢優爾生商貿有限公司)

1.2 方法

1.2.1實驗動物與分組：60只Wistar大鼠，均為雌性、未孕，體重220～260 g，由河南科技大學動物實驗室提供，生產許可證號：SCXK(豫)2014-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK(豫) 2014-0014。所有大鼠均在相同條件下進行飼養。隨機均分為假手術組、模型組及EPCs組，每組20只。

1.2.2EPCs的復蘇及培養：將EPCs恒溫水浴箱快速復蘇，待細胞完全融化后，離心棄上清，PBS洗滌細胞，以DMEM完全培養液對細胞重懸，調整EPCs濃度至2×l08/L，于37 ℃、5% CO2培養箱內培養，隔2 d換液1次，定期換液及傳代，培養1～14 d，觀察到細胞的增殖良好。

1.2.3模型的建立：吸入乙醚麻醉后固定大鼠，消毒皮膚后，以腰椎后正中位行皮膚切開，分離腰椎兩側肌肉，暴露并打開腹膜，顯露出雙側卵巢。模型組及EPCs組將雙側卵巢完全切除，假手術組同部位、同法切皮，僅切除卵巢周邊少許組織，但不行卵巢切除，手術完成后腹腔撒入青霉素粉末，依次逐層縫合組織和皮膚。 1周時進行尾靜脈注射治療，假手術組注射L-DMEM培養液0.5 mL、模型組注射L-DMEM培養液0.5 mL、EPCs組注射EPCs懸液0.5 mL，2×l08個/L，連續注射7 d。

1.2.4測定各組大鼠的體質量：造模后1、4、8、11、13周測定并記錄每組大鼠的體質量。過程如下，將體重計置于水平桌面，置“0”后體重計上測定小桶質量并記錄，后將各組每只大鼠分別置于小桶中測量并記錄，此讀數減去小桶質量讀數為大鼠體質量，重復3次測定，取均值。

1.2.5ELISA法檢測血清 25(OH)D、CTX-I、BAP、TRAP5b的表達變化：13周時，隨機取每組各5只大鼠，仰臥位固定后，經大鼠尾靜脈通過注射器采血，將血液注入離心管后，離心半徑140 mm，離心3 000 r/min，離心15 min。吸取上清液，通過ELISA法行血清25(OH)D、BAP、CTX-I、TRAP5b含量測定，按照試劑盒說明書進行，記錄檢測結果。

1.2.6骨密度及骨鈣含量測定:于造模后第13周，從每組大鼠中隨機選5只，通過頸部脫臼法處死。固定后，于無菌條件下取出大鼠的右側股骨，對大鼠股骨中點進行標記，分別行大鼠右側股骨中點、遠端及近端骨密度檢測。經骨密度儀測定并記錄結果。取左側股骨在支架上固定，用手術刀剔除股骨上附著的組織，剔除干凈后，用原子吸收法對股骨鈣含量進行測定并記錄。

1.2.7股骨生物力學檢測及HE染色：于造模后第13周，從每組大鼠中隨機選5只，通過頸部脫臼法處死。將大鼠在支架上固定，通過手術刀取出大鼠的股骨，用手術刀剔除股骨上附著的組織，然后對股骨的生物力學進行測試，通過三點彎曲實驗進行檢測，將每組大鼠處理后的股骨放在試驗機上測試，加載速度為2.0 mm/min，跨距設置為17 mm，根據結果描繪應力-應變曲線。然后用10%的甲醛行股骨固定，制作股骨組織切片；通過梯度乙醇脫水后，經過石蠟包埋，制作4～ 5 μm厚的連續切片，脫蠟，行HE染色，在光學顯微鏡下觀察。

1.2.8TGF-β1、Smad2、Smad3基因表達檢測：將各組剩余大鼠以頸部脫臼法處死，取大鼠椎體組織90 mg，液氮至凍后研磨，按照Trizol 試劑說明書步驟提取椎體組織總RNA，通過紫外分光光度計測定RNA的總含量，通過RT-PCR兩步法試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA。TGF-β1上游引物：5′-GTCAGACATTCGGGAGCAG-3′，下游引物：5′-AGACAGAAGTTGGCATGGTAGC-3′，產物長度為558 bp；Smad2上游引物：5′-GACTATACCCTCAATACCAT-3′，下游引物：5′-CGAAAGCCGTACTCCATTCCAG-3′，產物長度為610 bp; Smad3上游引物：5′-ACAATAACTTGGACCTACAGCC-3′，下游引物：5′-GTCAACTGGTAGACAGCCTCA-3′，產物長度為454 bp;內參GAPDH上游引物：5′- GAGGACCAGGTTGTCTCC TG-3′，下游引物：5′- GGATGGAATTGTGAGGGAGA -3′，產物長度為300 bp。PCR反應條件如下:于94 ℃條件下變性，1 min, 55 ℃溫度下退火，退火時長為30 s，于72 ℃延伸，延伸1 min，共45個循環。

1.2.9TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達檢測：將RT-PCR提取后的剩余物以1 500 r/min 離心30 min，取上清為粗體蛋白，通過BCA試劑盒行蛋白濃度測定。每組取蛋白40 μg，行10% SDS-PAGE凝膠電泳(條件為65 V，30 min；95 V，90 min)，蛋白電泳分離后通過半干法將蛋白電轉于硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h (或4 ℃過夜)；然后加入相應一抗TGF-β1、Smad2、Smad3鼠單抗(1∶100)、GAPDH鼠單抗(1∶800)4 ℃孵育過夜。PBS將未結合的抗體洗去，加入二抗羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育1 h，將未結合蛋白洗去，經ECL發光顯色后，X線照相后，通過Quantityone 軟件行灰度值統計分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 EPCs形態觀察

顯微鏡下觀察，培養1周內可見貼壁的EPCs逐漸增多，且體積增大，細胞形態呈紡綞形、多邊形或類圓形，見圖1 A；繼續培養1 周可見貼壁細胞形態呈“鋪路石”樣的外觀，細胞數顯著增多，表明細胞增殖良好，見圖1B。

圖1 EPCs形態觀察 (×100) A:傳代1周內的EPCs(×100);B:培養2 周時的EPCs(×100)。Fig.1 Morphological observation of EPCs A: EPCs within 1 week of passage (×100); B: EPCs at 2 weeks of culture (×100).

2.2 各組大鼠的體質量

大鼠的體質量測定結果表明三組大鼠的體重均逐漸增加，符合動物生長規律。于造模后8周起，模型組體質量較假手術組升高(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組大鼠的體質量比較Fig.2 Comparison of body mass in each group of rats

2.3 骨密度及骨鈣含量測定

在造模后第13周，模型組股骨骨密度及骨鈣含量較假手術組明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；EPCs組股骨骨密度和骨鈣含量較模型組顯著升高(P<0.05)，見表 1。表明EPCs移植治療能夠有效提高去卵巢骨質疏松大鼠骨密度和骨鈣含量，發揮治療作用。

2.4 各組大鼠25(OH)D、CTX-I、BAP、TRAP5b的表達變化

在造模后第13周，與假手術組比較，模型組血清25(OH)D、BAP水平降低，CTX-I、TRAP5b的水平升高(P<0.05)。與模型組比較，EPCs組血清25(OH)D、BAP水平升高，CTX-I、TRAP5b水平降低(P<0.05)。表明EPCs移植治療能夠有效地提高去卵巢OP大鼠血清25(OH)D、BAP水平、降低 CTX-I、TRAP5b水平，見表2。

表1 大鼠股骨BMD值和骨鈣含量測定Table 1 BMD and bone calcium content in rat femur

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表2 大鼠血清中25(OH)D、CTX-I、BAP、TRAP5b的表達Table 2 Expression of 25(OH)D, CTX-I, BAP and TRAP5b in rat serum

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

圖3 大鼠股骨組織病理學形態變化(×100)A：模型組;B：EPCs組;C：假手術組。Fig.3 Pathological changes in rat femoral tissue (×100) A：model group；B：EPCs group；C：sham operation group.

2.5 生物力學性能的變化

在造模后第13周，通過三點彎曲實驗檢測生物力學性能，顯示模型組極限載荷、極限應力和彈性模量明顯低于假手術組(P<0.05),EPCs組的極限載荷和彈性模量比模型組有顯著增高(P<0.05),見表3。

2.6 HE染色

圖3所示13周時，模型組骨小梁有斷裂，變稀疏，排列紊亂，間隙增大;EPCs組骨小梁窄較之減輕，部分骨小梁較粗，骨小梁排列較之規則、間隙增小于模型組;假手術組骨組織結構完整，以上病理變化進一步減輕。

表3 大鼠股骨生物力學檢測Table 3 Biomechanical testing of rat femur

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.7 TGF-β/Smad信號通路基因表達影響

圖4所示，TGF-β/Smads信號通路檢測顯示EPCs組TGF-β1及Smad2、Smad3基因表達上調，與模型組相比顯著升高，與假手術組相近(P<0.05)。表明EPCs移植可能通過調高TGF-β/Smads通路發揮作用。

圖4 各組椎體TGF-β/Smad基因表達 A:TGF-β/Smad 基因表達條帶圖;B:TGF-β/Smad 基因表達水平。Fig.4 TGF-β/Smad gene expression in vertebral body of each group A: TGF-β/Smad gene expression band map; B: TGF-β/Smad gene expression.

2.8 TGF-β/Smad信號通路蛋白表達影響

圖5所示， TGF-β/Smads信號通路檢測顯示EPCs組TGF-β1及Smad2、Smad3信號通路蛋白的表達，與模型組相比顯著升高，與假手術組相近(P<0.05)。表明EPCs移植可能通過調高TGF-β/Smads通路發揮作用。

圖5 各組椎體TGF-β/Smad蛋白表達 A:TGF-β/Smad 蛋白表達條帶圖;B:TGF-β/Smad 蛋白表達水平。Fig.5 TGF-β/Smad protein expression in vertebral body of each group A: TGF-β/Smad protein expression band map; B: TGF-β/Smad Protein Expression.

3 討論

骨質疏松為老年女性常見病之一，其根本原因為女性更年期后，機體雌激素水平逐漸降低[8]，骨吸收與骨形成的平衡受到影響，導致骨骼密度和骨鈣含量降低，最終骨強度變小，骨脆性增加，極易發生骨折[9]。大鼠卵巢摘除去勢手術建立的骨質疏松動物模型，模擬了這一疾病的生理條件和進程，為目前國內外篩選骨質疏松藥物和治療方案的首選動物模型[10]。EPCs是一群具有增生能力和能夠分化為血管內皮細胞的潛能干細胞， 能夠促進損傷血管的再生，在機體損傷修復過程中扮演著不可缺少的角色，在特定條件下可以分化為多種細胞，因此成為近些年來干細胞研究的熱點，并且取得了令人矚目的成績[6,11]。最近相關研究[12]表明EPCs還具有分化為造血細胞和成骨細胞的能力。同時臨床研究[13]表明老年人骨髓內皮祖細胞的數量與骨密度成顯著正相關,表明內皮祖細胞對骨組織新陳代謝可能有正調控作用，能夠有效提高老年人的骨量，減輕骨質疏松。由此可以推測若通過靜脈移植EPCs、提高體內成骨細胞的數量，可能對骨質疏松發揮治療作用。

本實驗通過大鼠去勢建立骨質疏松模型后，經EPCs尾靜脈移植進行干預。研究結果顯示移植后13周，與模型組相比，EPCs組大鼠血清25(OH)D、BAP水平升高，25(OH)D、BAP為成骨細胞活性增加的重要標志，表明EPCs移植后促進了骨質生成;CTX-I、TRAP5b的表達出現降低，CTX-I、TRAP5b為骨吸收主要標志物，表明EPCs移植后骨吸收減少。本研究顯示模型組骨密度和骨鈣含量較假手術組明顯降低，表明大鼠骨質疏松造模成功。EPCs移植組骨密度和骨鈣含量較模型組明顯升高，說明EPCs移植對去勢骨質疏松大鼠有治療作用。生物力學檢測表明，模型組極限載荷、極限應力和彈性模量明顯低于假手術組，EPCs組的極限載荷和彈性模量比模型組有顯著增高。進一步在基因蛋白水平對大鼠椎骨TGF-β/Smads信號通路的檢測顯示，EPCs組TGF-β1及Smad2/3的表達，與模型組相比顯著升高，與假手術組相近，表明EPCs大鼠尾靜脈移植能夠對卵巢骨質疏松大鼠起到有效的治療作用。

綜上，EPCs移植可能通過調控TGF-β/Smads通路發揮治療去卵巢大鼠骨質疏松癥的作用。