基于16S rRNA高通量測序技術分析I型骨質疏松大鼠腸道菌群結構變化

馬思聰 郝永強 富靈杰

上海市骨科內植物重點實驗室，上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院骨科，上海 200011

近年來，從骨免疫學及骨微生物學的新概念證實了腸道菌群與骨代謝之間的緊密聯系，干預與調節腸道菌群有望成為預防和治療絕經后骨質疏松癥的新策略[1-6]。目前，骨質疏松癥的腸道菌群結構改變的時間變化規律尚不清楚。本研究擬利用去勢大鼠構建I型骨質疏松癥動物模型，利用16S rRNA高通量測序技術分析比較去勢前后的腸道菌群的結構變化并提供較為詳細的實驗數據，為明確骨質疏松癥和腸道菌群的發病聯系提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

采用12周齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，共24只，體重228～265 g。由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物實驗中心提供(SCXK2012-0002)。

1.2 I型骨質疏松大鼠動物模型建立及糞便腸道菌群收集

SD大鼠適應性飼養1周后，隨機分為4組，每組各6只。去勢前組的6只大鼠收集骨骼和腸菌樣本。去勢后4周組、8周組、12周組各6只大鼠采用去勢法建立I型骨質疏松大鼠模型。具體方法是[7]：采用戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉，麻醉生效后，大鼠放置于俯臥位并固定四肢，腰背部消毒鋪巾。采用胸腰段后背直切口，從雙側肋脊角進入腹腔，依靠局部的脂肪組織辨認卵巢，順利結扎并切除卵巢，同法處理另一側卵巢組織。最后逐層縫合，關閉切口。術后于腹腔內注射鎮痛藥和抗生素，大鼠每2只置于單籠飼養，自由進食水，12 h光照周期。

采用DXA法測量去勢前組及去勢12周組的大鼠骨密度BMD，鑒定模型是否構建成功。收集去勢前和去勢后4周、8周、12周組的腸菌標本：采用直接收集法采集大鼠糞便，收集過程中嚴格采用無菌操作。每只大鼠收集0.25～0.45 g，儲存于-80 ℃冰箱。

1.3 16S rRNA高通量腸菌測序

1.3.1基因組DNA抽提及PCR擴增：采用DNA提取試劑盒E.Z.N.A.? Soil DNA Kit (D5625-01)，按照操作說明對每個大鼠糞菌樣本進行DNA提取。首先，用1%瓊脂糖凝膠電泳對抽提的基因組DNA檢測其完整性，并檢驗濃度和純度。其次，指定V3及V4可變區域并合成帶有barcode的特異引物。擴增體系具體為：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、Forward Primer (5 μmol/L) 0.8 μL、Reverse Primer (5 μmol/L) 0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、Template DNA 10 ng、補充dd H2O至20 μL。擴增條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，循環27次；72 ℃ 10 min。每個樣本重復3次，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN，美國)對PCR產物進行切膠并回收，Tris-HCl洗脫。利用2%瓊脂糖進行電泳檢測，參照電泳初步定量結果，利用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega，美國)對PCR產物進行檢測，按照每一個樣本的測序量要求進行對應比例的混合[8-9]。

1.3.2文庫構建與測序：區分樣本后采用Illumina平臺構建文庫并進行16S rRNA腸菌測序。

1.4 統計學處理

2 結果

與去勢前BMD比較，雌性SD大鼠去勢后12周的全身骨密度顯著下降(P<0.05)(圖1)，表明I型骨質疏松大鼠模型構建成功。

圖1 去勢大鼠骨質疏松模型的建立去勢前與去勢后12周的大鼠全身骨密度比較(P<0.05)。Fig.1 The establishment of ovariectomized rat model: comparison of total BMD between pre- and 12 weeks post-ovariectomy (P<0.05)

2.1 門(phylum)級別的物種差異變化

為了比較去勢前和去勢后不同時間點的大鼠的腸道菌群的物種差異，我們首先對比了24個樣本(4組，n=6)中的腸道菌群在腸菌的門(phylum)級別的物種組成(圖2)。結果顯示，厚壁菌門與擬桿菌門是腸道菌群的主要構成腸菌，無論在去勢前或去勢后，二者含量之和均超過腸道菌群總量的90%。其中，厚壁菌門在去勢后出現了下降的趨勢，一直持續到術后8周。然而，厚壁菌門的含量隨后出現了明顯的增加，并且這種增加和去勢前比較差異有統計學意義(P<0.05)。與此相反，擬桿菌門的含量在去勢后逐漸增加，一直持續到術后8周，隨后其含量顯著下降。變形菌門的含量沒有出現顯著性的變化(P>0.05)。

圖2 門(phylum)級別的物種差異變化Fig.2 Abundance difference in phylum level of gut microbiota

2.2 綱(class)級別的物種差異變化

綱是隸屬于門的分類級別，通過比較綱級別的物種差異能夠進一步細化腸菌變化特征(圖3)。梭菌綱(厚壁菌門)和擬桿菌綱(擬桿菌門)是含量最大的腸道菌群。梭菌綱的含量變化趨勢和厚壁菌門基本一致，在去勢后下降并持續到術后8周；同樣，在術后12周其含量顯著增高。類似的，擬桿菌綱的含量變化趨勢和擬桿菌門趨于一致。芽孢桿菌綱(厚壁菌門)在去勢術后8周顯著增多。

2.3 目(order)級別的物種差異變化

在目級別的腸道菌群構成上，梭菌目(梭菌綱)和擬桿菌目(擬桿菌綱)則是主要的腸道菌群(圖4)。梭菌目的變化規律和梭菌綱、厚壁菌門在各自級別的腸道菌群構成的變化規律趨于一致。而擬桿菌目的變化規律則和擬桿菌綱、擬桿菌門在各自級別的變化趨勢相似。另外，乳桿菌目在去勢12周時其含量顯著增加。

2.4 科(family)級別的物種差異變化

圖3 綱(class)級別的物種差異變化Fig.3 Abundance difference in class level of gut microbiota

圖4 目(order)級別的物種差異變化Fig.4 Abundance difference in order level of gut microbiota

圖5 科(family)級別的物種差異變化Fig.5 Abundance difference in family level of gut microbiota

隨著腸菌分類級別的細化，去勢大鼠的科級別的腸道菌群出現了較為復雜的變化(圖5)。首先，毛螺旋菌科(梭菌目)、s24-7(擬桿菌目)和瘤胃菌球科(梭菌目)是腸道菌群的主要構成腸菌。其次，毛螺旋菌科(去勢前：53.1%)在去勢后其含量顯著降低(去勢后4周：22.0%)，一直持續到術后8周(24.4%)，隨后其含量逐漸增高(去勢后12周：48.7%)。S24-7去勢后含量逐漸增加，而8周后其含量降低。瘤胃菌球科的含量在去勢后逐漸增加(去勢后12周：18.0%)。普雷沃氏菌科在去勢后12周顯著降低(P<0.05)。

2.5 屬(genus)和種(species)級別的物種差異變化

16S rRNA 測序法的優勢在于測序結合保守區和可變區，能夠將基因序列準確地歸類到屬級別。加以更加嚴格的對比條件，可以分析出樣本間的種級別差異(表1)。與術前比較，普雷沃氏菌屬(普雷沃氏菌科)、Odoribacter 含量在術后12周明顯降低(P<0.05)。而螺桿菌屬(螺桿菌科-彎曲菌目-ε變形菌綱-變形菌門)與Alistipes在術后12周含量增多(P<0.05)。在種級別的分類中，白色瘤胃球菌在術后12周顯著增多(P<0.05)。相反，單形擬桿菌含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

項目術前/(%)術后12周/(%)P值普雷沃氏菌屬6.1670±2.04300.7633±0.07470.045 螺桿菌屬0.0416±0.01300.3933±0.11460.027 YS20.0516±0.01010.0200±0.00730.031 Odoribacter0.0600±0.01090.0233±0.00550.019 Alistipes0.0216±0.00470.1300±0.03530.027

項目術前/(%)術后12周/(%)P值白色瘤胃球菌0.2139±0.04930.4368±0.06160.006 單形擬桿菌 0.0165±0.00850.0083±0.00210.005

3 討論

胃腸道內富含人體內種類最多、密度最大的微生物群落，按照界、門、綱、目、科、屬、種分類[10]。闡明腸道菌群及其代謝產物在絕經后骨質疏松癥發病過程中的變化規律和結構特征，是深入了解腸道菌群調節機制的重要前提。臨床研究發現，原發性骨質疏松癥患者的腸道菌群OTUs數量與Alpha多樣性高于對照組[8-9]。然而，也有研究顯示低骨量人群的OTUs和腸菌種類的數量低于對照組[11]。上述研究結果不一致的原因可能和其臨床試驗的入排標準、病例數量、性別比例等差異有關[12]。目前，腸道菌群在絕經后骨質疏松癥發病過程中的時間變化規律尚未完全闡明。

本研究通過去勢法構建I型骨質疏松動物模型，其優點是該模型是經典的I型骨質疏松癥的實驗研究使用的動物模型，其試驗動物間的個體差異較小。本研究發現，雌性大鼠去勢后，厚壁菌門的梭菌綱的梭菌目的毛螺旋菌科的螺桿菌屬，以及厚壁菌門的梭菌綱的梭菌目的瘤胃球菌科的白色瘤胃球菌屬，其含量在去勢后顯著增多，而擬桿菌門的擬桿菌綱的擬桿菌目的普雷沃菌科的普雷沃菌屬含量顯著下降。

16S rRNA測序技術是目前微生物系統實驗研究中鑒定腸道菌群的常用方法。我們發現在去勢后12周時，白色瘤胃球菌含量顯著增多，而單形擬桿菌的含量顯著降低，其差異具有統計學意義。雖然本研究不能證實骨質疏松癥的發生和這些腸菌含量變化之間的因果關系，未來應進一步利用腸菌移植等方法研究這些腸菌對骨質疏松癥發生的作用與影響，闡明特異腸菌對機體骨量變化的影響。在種(species)級別的腸道菌群測序上，宏基因組學的優勢在于其測序程度更深以及可測序列更加完整，但價格昂貴。因此，未來需進一步結合宏基因組學測序技術進一步驗證腸道菌群與骨質疏松癥的內在關系。

綜上所述，I型骨質疏松的腸道菌群數量和結構組成在門、綱、目等級別上發生了顯著性改變，為研究腸道菌群和骨質疏松癥的關系提供理論依據。