鈣蛋白酶參與tau蛋白過度磷酸化和截斷的機制研究進展

郭凱文，楊翠翠，張蘭

首都醫科大學宣武醫院藥學部，北京市神經藥物工程技術研究中心，北京腦重大疾病研究院，神經變性病教育部重點實驗室，北京市100053

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的特征性病理改變神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)是導致神經元退變的主要原因，可作為腦老化的標志，與AD 的認知功能障礙程度呈正相關[1]。微管相關蛋白tau能夠產生許多異常翻譯后修飾并聚集形成配對螺旋絲，NFTs 是配對螺旋絲進一步沉積形成的。其中，磷酸化和截斷是tau蛋白翻譯后修飾的主要形式，并且與AD 的發生和發展有著密切的關系[2-5]。鈣蛋白酶(calpain)是一種細胞內蛋白酶家族，通過專一性蛋白水解酶作用發揮其功能，在細胞活動、信號傳導、穩定細胞骨架結構等多個方面發揮作用，在AD 的發病過程中扮演重要角色[6-10]。最新研究表明[3,5]，鈣蛋白酶能夠調控tau 蛋白的截斷以及異常過度磷酸化。明確鈣蛋白酶與tau 蛋白異常翻譯后修飾之間的關系，有助于為抗AD 的新藥提供新的研究思路。本文對鈣蛋白酶的生理活性以及其對tau 蛋白磷酸化、去磷酸化和截斷等進行綜述。

1 鈣蛋白酶的結構

鈣蛋白酶是在體內有廣泛表達的保守的特異性依靠Ca2+激活的中性半胱氨酸蛋白酶[11]。自40多年前發現以來，鈣蛋白酶家族的成員已經與多種疾病的病理狀況相關，研究者們也對它們越來越關注。鈣蛋白酶家族共有15 個成員，它們大多數作為mRNA 被鑒定，有一些具有組織特異性[12-15]。引起研究者廣泛關注的有μ-calpain 和m-calpain，即在Ca2+濃度為μmol/L 和mmol/L級別下可以被激活的calpain 1和calpain 2[16]。

鈣蛋白酶由一個80 kDa 催化亞基和一個28 kDa 調節亞基組成[17-18]。其中大亞基由Capn1和Capn2基因編碼，具有4個結構域。小亞基由Capn4基因編碼，具有2 個結構域。其中Capn4是calpain 1和calpain 2活性所需求的[19]。

2 鈣蛋白酶的活性調節

鈣蛋白酶的活性主要受細胞內Ca2+濃度的調節[20-21]。在未激活時，蛋白酶結構域II 的兩個亞結構域(IIa 和IIb)是分開的。鈣蛋白酶的激活主要有兩個階段。第一階段，在Ca2+的存在下，這兩個亞結構域結合，發生構象改變，這是激活鈣蛋白酶和形成活性催化位點的必要條件。Ca2+與結構域III、IV 和VI中的EF-手性螺旋結合，從而將結構域II 與結構域III 分開。因此，在第一階段結束時28 kDa 小亞基與80 kDa 大亞基解離。第二階段，蛋白酶結構域II上的活性位點被重排，參與底物的水解過程[22]。鈣蛋白酶的活性也可以通過它的水解片段來反映。

鈣蛋白酶有超過100 種不同的底物，在正常生理條件下它們受到嚴格的控制，防止大量蛋白水解產生破壞性的后果。但是隨著年齡的增長，尤其是患有糖尿病，肌營養不良以及認知障礙的患者，這種調節能力減弱，鈣蛋白酶的活性升高[8]。

鈣蛋白酶抑制劑(calpastatin,CS)是體內唯一的特異性鈣蛋白酶家族抑制劑。在一項研究中calpain 2 的Ki值為10 nmol/L，證明CS對激活的鈣蛋白酶的親和力非常高[9]。在鈣蛋白酶未激活的正常生理條件下，CS 的缺乏不會導致生殖、發育或行為異常。相反，紅藻氨酸誘導的神經毒性會導致鈣蛋白酶催化的蛋白水解水平上調或下調，CS 敲除(CS-KO)和CS 過表達小鼠會發生神經退行性變化，表明CS 在病理條件下可以抑制鈣蛋白酶的活性[23]。

3 鈣蛋白酶與tau蛋白

在AD 中出現的鈣蛋白酶激活，會引起Ca2+穩態的紊亂，從而導致神經元死亡[24]。有研究發現[15]，在AD 患者腦脊液中，蛋白酶的表達和活性升高，鈣蛋白酶的活化由可溶性β-淀粉樣蛋白激活N-甲基-D-天冬氨酸受體介導。另有研究表明[25]，鈣蛋白酶內源性抑制劑CS 能抑制神經細胞凋亡，對神經細胞起到一定的保護作用。

AD患者腦內tau蛋白磷酸化程度比普通人高3～4倍。tau蛋白磷酸化主要受磷酸激酶和磷酸酶的共同調節維持平衡，當這種平衡被打破，會造成tau 蛋白異常過度磷酸化，過度磷酸化的tau 蛋白聚集能力顯著上升，失去原本的功能，以螺旋絲的形式聚集形成NFTs，造成神經元的變性損傷[26]。鈣蛋白酶在tau 蛋白磷酸化和去磷酸化過程中起重要作用，并且對tau 蛋白的截斷也有影響。

3.1 鈣蛋白酶與tau蛋白磷酸化

糖原合成酶激酶3(gycogen synthase kinase 3,GSK3)是生物體內廣泛分布的一種絲/蘇氨酸磷酸激酶，已知有GSK3α、GSK3β 兩種同工酶。其中，GSK3β 在細胞質、細胞核和線粒體內均有表達，參與調節多種細胞過程，如胚胎發育、凋亡、細胞分化、細胞增殖和細胞遷移等。GSK3β 是腦內誘導tau 蛋白過度磷酸化的主要磷酸激酶，可促進tau蛋白在多個與AD發生相關的位點磷酸化，例如Thr205、Thr212、Ser214、Thr217和Ser396/404 等[27-29]。SK3β 與AD 發病的主要病理機制有關，包括GSK3β 與Aβ 之間的相互作用[30]，可以磷酸化tau 蛋白[31]，可以與早老素和其他AD 蛋白相互作用，以及GSK3β對細胞凋亡的影響[32]。此外，GSK3β 參與記憶障礙的病變過程，抑制GSK3β 的活性，可改善學習和記憶。以上結果說明，GSK3β具有影響細胞存活，調節神經元可塑性、神經元分化和基因表達的重要作用，GSK3β 可能是神經退行性疾病如AD 發病機制的關鍵因素[30,33]。

calpain 1 和calpain 2 對GSK3β 的蛋白水解作用相似。通過calpain 1 截斷GSK-3β 的C-末端(氨基酸382-433)顯著增強GSK3β 對tau 蛋白磷酸化的活性，從而導致AD 患者腦中tau 蛋白過度磷酸化和神經原纖維變性。腦組織提取物與Ca2+共孵育發現，鈣蛋白酶的激活可以使GSK3β 的抑制性結構域N 末端被切割，表明鈣蛋白酶以某種方式促進GSK3 截斷，這種方式可能會影響信號傳導，并可能導致諸如AD等病理性疾病[34]。

相反，GSK3β不同位點的磷酸化可以影響鈣蛋白酶介導的切割作用[35]。GSK3β在Ser9位點的磷酸化可以消除鈣蛋白酶介導的C 末端和N 末端的切割，而GSK3β 在Ser389 位點的磷酸化僅抑制N末端切割[36]。

3.2 鈣蛋白酶與tau蛋白去磷酸化

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是真核生物體內的絲氨酸和蘇氨酸蛋白磷酸酶，能使蛋白質脫磷酸化，在tau 蛋白的脫磷酸化作用中，PP2A 占71%[8]。PP2A 是一種異源三聚體磷酸酶，由結構亞基、調節亞基和催化亞基三個部分構成。調節亞基有B/PR55、B'/PR61、B''/PR72、B'''/PR93 四種亞型，其分布具有組織特異性。在體內，PP2A 有1/3以核心酶形式存在，剩下2/3以全酶形式存在。

PP2A 表達的失調可能加速AD 的發展。AD 患者腦中PP2A 活性顯著降低，在基因和蛋白質水平上，PP2A 的各種亞基(如PP2Ac)表達均減少[37-38]。神經元中tau 蛋白有多個絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化位點，它的過度磷酸化會影響微管的結合和解離，形成神經內NFTs，從而中斷微管網絡，引起認知障礙。

在降低tau 蛋白過度磷酸化的過程中，鈣蛋白酶可以直接或間接作用于磷酸酯酶，主要表現為抑制PP2A 的表達。岡田酸處理和PP2A 催化亞基的沉默都可以減少饑餓誘導的FoxO3A 活化以及Capn4敲除的成纖維細胞的凋亡[39-40]。PP2A與Capn4敲除細胞中的Akt 更緊密地結合，表明PP2A 參與鈣蛋白酶介導的FoxO調節。PP2A調節亞基B56α和γ是鈣蛋白酶的體外底物，并且鈣蛋白酶調節體內B56α 穩定性，calpain 1的激活可以導致PP2A 調節亞基B56α 的截斷[41]。calpain 2 在Ca2+的存在下可以將調節亞基B''/PR72α2 和B''/PR130α1 水解成45～48 kDa 蛋白片段('PR45')。鈣蛋白酶會減弱PR72 核心酶的相互作用，激活PP2A并顯著增加其對聚陽離子的敏感性[42]。

3.3 鈣蛋白酶與tau蛋白的截斷

在體外，calpain 1 在正常和患病位點均有特異性切割，并且位點的選擇是構象依賴性的，tau 蛋白單體主要在G323/G326 (正常位點)處切割，而tau 蛋白寡聚化增加AD 相關位點的切割[43]。tau 蛋白單體通過鈣蛋白酶介導的tau 蛋白截斷誘導神經變性，導致17 kDa神經毒性肽的積累和細胞凋亡[44]。

3.4 其他

在一些因素如興奮性毒素、缺氧和Ca2+內流等的作用下，鈣蛋白酶會被激活，被激活的鈣蛋白酶可以將p35 剪切為p25，具有較高的磷酸化活性和神經毒性的細胞周期素依賴蛋白激酶5 (cyclin-dependent kinase 5,CDK5)-p25 復合物，可以增強tau蛋白在Ser202和Thr205位點的磷酸化[13]。因此鈣蛋白酶的過度激活會導致NFTs的產生。

目前研究表明，在AD中鈣蛋白酶對tau蛋白過度磷酸化和截斷有直接或者間接的作用，鈣蛋白酶有望成為治療AD 的新思路。因此，針對鈣蛋白酶對tau 蛋白磷酸化和截斷的作用機制的研究可能為AD的藥物治療打開新局面。