綠原酸對銀屑病樣模型小鼠皮損組織炎癥抑制作用及神經遞質SP/NK1R表達的影響①

郭簡寧 李 萍 趙京霞 底婷婷 張 璐 王 燕

(首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京市中醫研究所，銀屑病中醫臨床基礎研究北京市重點實驗室，北京 100010)

銀屑病是一種慢性復發性炎癥性皮膚疾病，其發病機制尚不明確。研究表明，銀屑病也是一種身心疾病，對136例銀屑病患者和146例體檢健康者的臨床研究結果顯示：銀屑病患者焦慮情緒發生率為89.7%，遠高于正常對照組焦慮情緒發生率28.8 %[1]。銀屑病患者所伴發的焦慮與抑郁等癥狀，嚴重影響患者的生活質量，甚至導致疾病遷延不愈或惡化[2,3]。研究發現，焦慮、抑郁狀態可引起中樞神經系統神經遞質分泌增加，進而導致皮膚神經纖維在皮損局部分泌更多的神經遞質，通過神經免疫調節，放大局部皮損的炎癥反應[4]。臨床和基礎研究均表明，抗焦慮抑郁、干預神經遞質對銀屑病的治療具有一定的療效[5-7]。

綠原酸(Chlorogenic acid)，是一種苯丙素類化合物，它廣泛存在于忍冬科忍冬屬、菊科蒿屬植物中，提取物來源于中藥杜仲、金銀花、白茅根等，這些中藥均為治療銀屑病的常用中藥[8]。綠原酸具有廣泛的藥理作用，除抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎等作用外[9]，其腸道代謝產物有一定抗焦慮抑郁作用[10,11]，然而目前尚未見綠原酸治療銀屑病研究的相關報道。綜合以上研究基礎，我們推測綠原酸治療銀屑病的可能機制，是否與抗焦慮抑郁、調節神經遞質相關，因此本研究通過咪喹莫特誘導建立銀屑病樣小鼠模型，從改善皮損炎癥、調節神經遞質SP表達、緩解焦慮的角度，探究綠原酸治療銀屑病的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 45只雄性BALB/c小鼠，體質量18～20 g，6～8周齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證編號SCXK(京)2014-0013。

1.1.2試劑與藥物 綠原酸購自美國Sigma-Aldrich公司，甲氨蝶呤片購自上海信誼藥廠有限公司，5%咪喹莫特乳膏為四川明欣藥業有限責任公司生產，DAB顯色液、山羊血清工作液和3%(質量分數)H2O2去氧離子水均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，增殖細胞核抗原PCNA抗體購自美國Abcam公司，Substance P和NK1R單克隆抗體購自美國Affinity公司，Tubulin鼠單抗購自中國北京冠星宇科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3儀器與設備 高速冷凍離心機(Centrifuge 5415D)由德國Eppendorf公司提供；脫水機(ASP6025)、包埋機(EG1150)、石蠟切片機(RM2255)、烤片機(HI1220)、HE半自動染色儀(AU-TOSTAINER XL)均由德國Leica公司提供。曠場、高架迷宮由上海欣軟信息科技有限公司提供，視頻分析系統軟件為Supermaze。

1.2方法

1.2.1動物造模、分組、給藥 參考 van der Fits 等[12]小鼠銀屑病樣模型制備方法造模。實驗前戊巴比妥鈉(80 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，背部備皮，面積約2 cm×3 cm，備皮后單籠飼養。依據隨機數字表法，將小鼠隨機分為空白對照組、模型組、甲氨蝶呤組、綠原酸高、低劑量組，每組9只。各組造模小鼠灌胃治療2 h后，每日1次，連續6 d，第7天取材。具體造模及給藥方法如下：①空白對照組小鼠給予0.9% (質量分數)氯化鈉注射液0.2 ml；背部涂抹凡士林乳膏。②模型組小鼠給予0.9% (質量分數)氯化鈉注射液0.2 ml；背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg。③甲氨喋呤組小鼠給予1 mg/kg甲氨蝶呤片溶液0.2 ml；造模同模型組。④綠原酸高劑量組小鼠給予等量100 mg/kg藥液，低劑量組給予等量50 mg/kg藥液；造模同模型組。

1.2.2檢測指標及方法

1.2.2.1小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴重程度評分(PASI評分) 每日對實驗小鼠皮損進行拍照，根據PASI評分標準，鱗屑、浸潤和紅斑按0～4分評價：0分=無；1分=輕微；2分=中度；3分=重度；4分=極嚴重。每日記錄統計分析各組小鼠鱗屑、浸潤和紅斑分值，將三者分值相加計算總分，繪制PASI評分趨勢圖，動態觀察小鼠皮損的變化情況。

1.2.2.2測量小鼠皮損表皮厚度 造模第7天取材，取一部分小鼠背部皮膚固定于福爾馬林中，脫水、包埋后制備5 μm石蠟切片。用蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色，通過光學顯微鏡觀察各組小鼠皮膚形態學變化，每個標本選5張不同切片進行拍攝，采用ZEN軟件測量表皮厚度。

1.2.2.3免疫組化法檢測小鼠表皮層PCNA表達和真皮層CD3陽性T淋巴細胞浸潤情況 制備5 μm石蠟切片，免疫組織化學法(Immunohistoche-mistry，IHC)檢測PNCA、CD3的表達。在400倍鏡下，每例標本隨機選取5個視野并拍照，運用IPP 6.0圖像分析軟件記錄陽性細胞數量。

1.2.2.4曠場實驗 造模第5天進行曠場實驗。該儀器由50 cm×50 cm×50 cm的隔板箱組成，曠場上方安裝攝像頭，連接電腦，利用Supermaze軟件將曠場劃分25宮格，具體分為中央區和四邊區兩個測量區域。實驗前，提前將待測小鼠放入臨時籠盒適應，減少小鼠緊張；實驗開始將小鼠放置于曠場中央區，記錄5 min內小鼠的活動情況，包括中央區運動路程、中央區停留時間和中央區進入頻率。在每只小鼠測量間隙，用75%酒精清潔曠場內尿液、糞便，防止其他小鼠留下的氣味影響實驗。

1.2.2.5高架十字迷宮 造模第6天進行高架十字迷宮實驗。該儀器由兩條開放臂(50 cm長×10 cm 寬)、兩條閉合臂(50 cm長×10 cm寬×40 cm高)及中央區(10 cm長×10 cm寬)組成，開臂與閉臂相互垂直“十”字交叉。高架十字迷宮上方安裝攝像頭，連接電腦，利用Supermaze軟件將實驗區域劃分為中央區、開臂和閉臂區域；具體操作同礦場實驗，將小鼠放入中央區且面對開臂，記錄5 min內小鼠的活動情況，包括進入開臂次數(Open arm entry，OE)，開臂時間(Open arm time，OT)，閉臂次數(Close arm entry，CE)，閉臂時間(Close arm time，CT)；根據上述指標分別計算出：進入開臂次數比例(OE%):OE/(OE+CE)×100%，開臂停留時間比例(OT%):OT/(OT+CT)×100%。

1.2.2.6Western blot法檢測皮損組織中SP、NK-1R蛋白表達 各組小鼠皮損組織加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，電動勻漿機勻漿后，冰上裂解20 min，12 000 r/min 4℃離心5 min，分裝保存上清液。BCA法進行蛋白定量。蛋白樣品電泳后濕轉膜，5%脫脂牛奶封閉，室溫輕搖60 min，加入一抗，4℃過夜。洗膜后二抗孵育1 h，再次洗膜，膠片曝光，顯影、定影。曝光后的膠片直接掃描，軟件Image J讀取條帶的IOD值。

2 結果

2.1綠原酸對咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠皮損的影響 每日觀察各組小鼠皮損變化，空白對照組小鼠皮膚始終白嫩，無鱗屑、紅斑和浸潤皮損；模型組小鼠從第2天開始，皮膚出現輕微紅斑和浸潤，其背部皮損，隨造模時間的推移不斷加重，第7天皮損最嚴重，皮損干燥，鱗屑肥厚，表皮紅腫，浸潤明顯；甲氨喋呤組和綠原酸各劑量組與模型組同期相比，鱗屑、紅斑和浸潤減輕，其中甲氨喋呤組與綠原酸低劑量組小鼠皮損改善最為明顯，見圖1。

每日評價記錄PASI評分，繪制趨勢圖，空白對照組小鼠背部皮膚正常無明顯改變，其鱗屑、紅斑、浸潤和總分分值始終為0；其余各組小鼠造模第2天出現輕微皮損，其鱗屑、浸潤、紅斑和總分分值，隨造模時間推移，不同程度的升高，于第7天達到峰值；模型組小鼠與空白對照組相比，其鱗屑、浸潤、紅斑和總分分值顯著升高(P<0.001)；甲氨喋呤組和綠原酸低劑量組與模型組相比，鱗屑、浸潤、紅斑和總分分值顯著降低(P<0.05)；綠原酸高劑量組與模型組相比，可降低浸潤分值(P<0.05)，見圖2。

2.2綠原酸對咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠皮損組織形態及表皮厚度的影響 HE染色結果顯示，空白對照組小鼠皮膚表皮層薄，細胞浸潤少；模型組小鼠與空白對照組相比，表皮層明顯增厚，角化不全及角化過度較多、炎性細胞浸潤嚴重，角質層可見大量Munro微膿腫；甲氨喋呤組和綠原酸各劑量組小鼠與模型組相比，表皮層均變薄，角化不全和角化過度減少，炎性細胞浸潤及Munro微膿腫減輕，見圖3。

經測量分析發現，模型組小鼠與空白對照組相比，表皮層厚度顯著增厚(P<0.001)；甲氨喋呤組和綠原酸各劑量組表皮厚度均顯著低于模型組(P<0.001)，其中綠原酸高劑量組表皮厚度低于甲氨喋呤組(P<0.05)，見圖4。

2.3綠原酸對銀屑病樣小鼠皮損組織中PCNA和CD3+T淋巴細胞表達的影響 PCNA為增殖細胞核抗原，可反映銀屑病角質細胞增殖狀態[13]。免疫組化法可觀察到皮損組織中PCNA陽性細胞被染成棕色。空白對照組小鼠皮膚組織PCNA表達于基底層，呈線性分布；模型組小鼠廣泛表達于表皮層，其陽性細胞數量較空白對照組明顯增多(P<0.001)；甲氨喋呤組和綠原酸各劑量組PCNA陽性細胞數量均較模型組顯著減少(P<0.001)，見圖5及表1。

我們可在小鼠皮損真皮層中觀察到CD3陽性T淋巴細胞浸潤情況，CD3陽性T細胞呈棕色點。空白對照組小鼠真皮層CD3陽性細胞數量少， 模型組與空白對照組相比，小鼠皮損組織中CD3陽性細胞數量顯著增多(P<0.001)，甲氨喋呤組和綠原酸各劑量組與模型組相比，CD3陽性細胞數量顯著減少(P<0.001),見圖6及表1。

圖1 各組小鼠第7天時皮損表現Fig.1 Skin lesions of mice in each group on the 7th day

圖2 各組小鼠皮損PASI評分趨勢圖Fig.2 PASI scores of mice skin lesions in each groupNote:Compared with control group,###.P<0.001;compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖3 各組小鼠皮膚組織形態學觀察(HE染色，×400)Fig.3 Histomorphology observation of mice skin tissue in each group(HE staining,×400)

2.4礦場實驗 礦場實驗結果顯示，中央區路程：模型組小鼠與空白對照組相比， 其中央區路程顯著減少(P<0.05)、綠原酸各劑量組與模型組相比，中央區路程有一定升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；中央區時間：模型組小鼠與空白對照組相比，中央區時間顯著減少(P<0.05)，綠原酸各劑量組與模型組相比，中央區時間有升高趨勢，但沒有統計學意義(P>0.05)；進入中央區頻率：模型組小鼠與空白對照組相比，進入中央區頻率減少，但兩組之間無統計學意義(P>0.05)，綠原酸各劑量組小鼠與模型組相比,進入中央區頻率有升高趨勢，但沒有統計學意義(P>0.05)，見圖7。

圖4 各組小鼠皮損組織表皮厚度比較Fig.4 Epidermal thickness of mice skin lesionsNote:Compared with control group,###.P<0.001;compared with model group,***.P<0.001;compared with MTX group，△.P<0.05.

圖5 各組小鼠皮損組織中PCNA表達(×400)Fig.5 Expression of PCNA in mice skin lesions(×400)

圖6 各組小鼠皮損組織中CD3陽性T淋巴細胞表達(×400)Fig.6 Expression of CD3 positive T lymphocytes in mice skin lesions(×400)

2.5高架十字迷宮實驗 高架十字迷宮實驗結果顯示，空白對照組小鼠與模型組相比，OT%有一定升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，綠原酸各劑量組與模型組相比，結果同空白組(P>0.05)，見圖8。

2.6綠原酸對咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠皮損中SP、NK1R蛋白表達的影響 與空白對照組相比，模型組小鼠皮損中NK1R蛋白表達量有增高的趨勢；甲氨喋呤組、綠原酸各劑量組與模型組相比，NK1R蛋白表達量均有降低趨勢，差異無統計學意義(P>0.05)。模型組小鼠皮損SP蛋白表達顯著高于空白對照組(P< 0.001)，與模型組相比，綠原酸低劑量組可降低皮損SP的表達(P<0.05)，見圖9。

GroupsNumber of PCNA Number of CD3 positive cellsControl group31.22±3.298.143±0.96Model group90.89±2.531)33.86±1.641)MTX group58.33±2.712)20.57±1.342)CAL group59.44±6.782)20.08±0.962)CAH group47.56±4.132)18.75±1.232)

Note:Compared with control group,1)P<0.001;compared with model group,2)P<0.001.

圖7 各組小鼠行為活動評分比較Fig.7 Behavioral activity scores of mice in each groupNote:Compared with control group,#.P<0.05.

2.7皮損中SP、NK1R蛋白表達與CD3陽性T淋巴細胞浸潤情況的相關性分析 SP和NK1R等計量資料均呈正態分布，采用雙變量相關分析統計SP、NK1R蛋白相對表達量與CD3陽性T淋巴細胞數量的相關性，皮損SP、NK1R蛋白相對表達量與CD3陽性T淋巴細胞數量皆呈正相關，即SP和NK1R神經遞質表達量越高，CD3陽性T淋巴細胞數量越多，小鼠背部皮損炎癥浸潤越嚴重，見圖10。

圖8 各組小鼠OE%和OT%比較分析Fig.8 Analysis of OE% and OT% in each group of miceNote:OE% is the proportion of times to enter the open arm,and OT% is the proportion of time to stay in the open arm.

圖9 各組小鼠皮損組織中NK1R、SP蛋白相對表達Fig.9 Relative expressions of NK1R and SP proteins in mice skin lesions of each groupNote:Compared with control group,###.P<0.001;compared with model group,*.P<0.05.

圖10 皮損中SP、NK1R蛋白相對表達量與CD3陽性T淋巴細胞數量關系Fig.10 Relationship between relative expression of SP and NK1R proteins in skin lesions and number of CD3 positive T lymphocytes

3 討論

銀屑病是一種身心免疫性疾病[14]，其病理過程有多種免疫細胞參與，在外源性因素與內源性因素的作用下，免疫細胞被激活，釋放多種炎性細胞因子，導致皮損局部產生炎癥反應，并刺激角質形成細胞異常增殖分化[15]。精神壓力屬于銀屑病發病的外源性因素之一，焦慮抑郁等消極情緒既是銀屑病發病的起因，也是使癥狀加重的不利因素；這些消極情緒的發生會使機體神經元過度分泌神經遞質，導致神經遞質調控的免疫細胞過度活化產生細胞因子，加重皮損炎癥反應，使疾病遷延不愈或惡化[16]。Ward等[17]發現，在切除KC-Tie2轉基因銀屑病小鼠神經后，銀屑病小鼠局部免疫細胞數量減少、表皮厚度降低、皮膚炎癥減輕；注射SP激活劑，銀屑病皮損和炎癥反應加重；注射SP拮抗劑，皮損和炎癥反應都得到改善，由此可見，干預神經遞質SP可作為治療銀屑病的靶點之一。

本研究采用咪喹莫特涂抹小鼠背部皮膚造模，隨著造模時間推移，模型組小鼠背部皮膚干燥，出現白色鱗屑、紅斑和浸潤等癥狀，并隨時間推移不斷加重；HE染色發現其皮損表皮厚度顯著增加，并存在大量角化不全和角化過度；免疫組化實驗中PCNA是顯示角質形成細胞增殖狀態的標志物，CD3可顯示皮損T淋巴細胞炎癥浸潤程度，模型組小鼠皮損角質形成細胞異常增殖，真皮存在T淋巴細胞炎癥浸潤，符合臨床銀屑病患者的皮損表現和病理。

使用綠原酸干預咪喹莫特誘導的銀屑病樣模型小鼠，結果發現綠原酸可緩解銀屑病樣小鼠鱗屑、紅斑和浸潤情況，減少角化不全和過度角化，降低表皮厚度，緩解表皮層角質形成細胞過度增殖及皮損局部炎癥反應。為了進一步探究其作用靶點，我們觀察綠原酸對銀屑病樣模型小鼠焦慮行為學及神經遞質的影響。

綠原酸對銀屑病樣模型小鼠焦慮行為學的影響：曠場實驗和高架十字迷宮實驗是評價小鼠焦慮狀態的經典行為學實驗[18,19]，我們在曠場實驗中觀察到空白對照組小鼠進入中央區路程、中央區時間、中央區頻率均顯著高于模型組，而高架十字迷宮實驗結果顯示，空白對照組OT%較模型組有一定升高趨勢，而OE%趨勢不明顯，我們猜測可能與樣本量大小有關，以上結果提示咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠可能存在焦慮癥狀，與劉正榮[7]的研究結果一致。與模型組相比，綠原酸可提高小鼠中央區路程、中央區時間、中央區頻率、OE%和OT%，在一定程度上可以改善小鼠的焦慮程度。

綠原酸對銀屑病樣模型小鼠神經遞質SP/NK1R的影響。臨床中銀屑病患者伴隨焦慮癥和抑郁癥共病的發生率較高，這些患者皮損中SP的表達顯著高于對照組[2,20]，NK1R是SP結合免疫細胞并產生信號傳遞作用的關鍵受體，連接神經免疫調節的關鍵靶點[21]，SP及其受體NK1R在焦慮抑郁疾病中起重要的調節作用[22]，并且共同參與銀屑病神經免疫炎癥的病理過程[23]。本研究發現，模型組小鼠皮損組織中NK1R與SP蛋白的表達量均高于空白對照組，而綠原酸治療組小鼠皮損組織NK1R與SP蛋白的表達較模型組明顯減少。推測綠原酸可能通過降低SP及其受體NK1R的表達，緩解小鼠焦慮程度。神經免疫調節介導銀屑病的始終[24,25]，進一步對焦慮相關神經遞質表達量與小鼠皮損組織炎癥程度進行相關性分析，發現NK1R、SP的相對蛋白表達量與CD3陽性T淋巴細胞數量呈正相關，即焦慮相關神經遞質表達量越高，銀屑病樣小鼠焦慮程度增加，局部皮損組織炎癥反應越嚴重。綜上提示綠原酸可能通過降低皮損組織中NK1R與SP的表達，緩解小鼠焦慮程度，降低炎癥反應，從而改善小鼠銀屑病樣皮損。