基于氧化應激與Treg細胞探討補烏煎劑聯合308準分子治療進展期白癜風的作用機制①

章 緯 張虹亞 劉濤峰 王建鋒 于慶生

(安徽中醫藥大學研究生院，合肥 230031)

白癜風是一種常見的以表皮基底層黑素細胞選擇性破壞和進行性丟失以及免疫功能紊亂為特征的損容性疾病，易診難治[1]。引起黑素細胞選擇性破壞的機制包含許多假說，近年來研究表明，氧化應激與白癜風發生發展密切相關，氧化應激誘導黑素細胞損傷是其發病的始動環節，而損傷機制往往涉及Treg細胞功能障礙[2]。Treg細胞是一種獨特的細胞亞群，在建立機體的免疫耐受和維持機體穩態中發揮重要作用，其數量或功能異常在包括白癜風等在內的多種疾病的免疫反應過程中承擔重要角色[3]。大量研究表明中藥復方制劑可通過調節免疫、促進黑素細胞的增殖、激活酪氨酸酶活性等協同“多靶點”作用治療白癜風，那么中藥復方是否也通過抗氧化作用或/和調節Treg細胞功能治療白癜風？本研究在觀察中藥補烏煎劑聯合308準分子治療進展期白癜風臨床療效的基礎上，進一步從調節氧化-抗氧化失衡以及CD4+CD25+CD127LOW/-Treg細胞水平的角度探討其作用機制。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1診斷標準 ①白癜風診斷標準：西醫診斷標準參照趙辨主編《中國臨床皮膚病學》[4](2010版)和中西醫結合學會皮膚性病專業委員會色素病學組修訂的《白癜風的臨床分型及療效標準》[5](2003)有關標準擬定：癥見局限性的色素脫失性白斑，大小不一，形狀近圓形、橢圓形或者不規則形，白斑處毛發可以變白或者不改變。進展期判斷標準參考(VIDA積分)：+4分：近6周內出現新皮損或原皮損擴大；+3分：近3個月出現新皮損或原皮損擴大；+2分：近6個月出現新皮損或原皮損擴大；+1分：近1年出現新皮損或原皮損擴大；0分：至少穩定1年；-1分：至少穩定1年且有自發色素再生。總分>1分即為進展期，≥4分為快速進展期；②中醫癥候診斷標準:根據中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會色素病學組制定的《白癜風臨床分型及療效標準(2003 年修訂稿)》證型為肝腎不足型[5]，癥見：白斑無消退或出現新發，伴倦怠乏力，腰膝酸軟，或五心煩熱。舌質紅、苔少、脈沉細。

1.1.2納入標準 ①凡符合白癜風西醫診斷標準，中醫辨證為肝腎不足型者；②近6個月內有新發皮損或皮損面積擴大；③皮損面積不超過身體面積的20%；④年滿16周歲且不大于70周歲者。

1.1.3排除標準 ①伴其他的自身免疫性疾病；②3個月內曾系統應用免疫抑制劑或糖皮質激素治療的患者；③皮損面積超過體表面積的20%或對中藥補烏顆粒不能耐受者；④妊娠或哺乳期婦女；⑤更換治療方法或不能完成治療方案者。

1.1.4一般資料 選擇2017年3月至2018年12月就診于安徽省中醫院皮膚科門診確診的65例進展期白癜風患者，3例失訪，最終31例患者采用308 nm準分子光照射治療納入對照組，31例患者采用中藥補烏煎劑聯合308準分子光治療納入觀察組。觀察組:31例，女16例，男15例，年齡18～63歲，平均(37.32±13.22)歲，病程3～147月，平均(35.89±35.66)個月；對照組:31例，女17例，男14例，年齡19～64歲，平均(39.26±13.85)歲，病程2～152個月，平均(31.37±37.02)月，兩組年齡、性別、病程等一般資料比較，差異均無統計學意義，具有可比性。患者填寫白癜風流行病學資料，簽署知情同意書。

1.1.5主要儀器和試劑 SOD 試劑盒(A001-1 & 20190708)、MDA試劑盒(A003-1-1 & 20190709)、CAT 試劑盒(A007-1-1 & 20190711)、GSH-Px試劑盒(A005-1-1 & 20190703)購自南京建成。Human CD4-FITC(貨號：300506)，Human CD25-PE(貨號：302605),Human CD127-APC(貨號：351315)購自廠家Biolegend,流式細胞儀購自貝克曼庫爾特NAVIOS。

1.2方法

1.2.1治療方法

1.2.1.1對照組 給予308 nm 準分子光照射治療。308 nm 準分子光(半島醫療集團，xecl-308)，光源類型為xecl準分子光，根據不同部位選取不同的初始治療劑量，設置為100～500 mJ/cm2，對大腿內側、面部皮損等皮膚薄嫩部位適當降低能量，對四肢末端處皮損適當增加能量，根據紅斑反應情況確定下一次照射時間與劑量，照射為2～3次/周。

1.2.1.2觀察組 在對照組的基礎上給予中藥補烏煎劑聯合治療(補骨脂10 g、烏梅10 g、菟絲子15 g、女貞子15 g、旱蓮草15 g、刺蒺藜10 g、郁金10 g、香附10 g、丹參15 g、桃仁10 g、自然銅10 g)，內服方法：每日一劑，水煎取汁300 ml，分早晚兩次飯后半小時溫服。兩組患者治療3個月為一個療程。

1.2.2指標觀察方法

1.2.2.1療效評定[6]療程結束后觀察療效，療效以復色面積占皮損總面積的百分比為準，基線為納入觀察前皮損面積。出現無變化為穩定，復色為好轉，新皮損為發展。好轉以復色面積的大小分為4個等級，分別為≤25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%。復色面積≥50% 統稱為顯效，顯效率=(顯效例數/總例數)×100%，總有效率=(好轉例數+穩定例數)/總例數×100%。

1.2.2.2白癜風的皮損面積及色素評分[7]根據中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會色素病學組制定的白癜風診療標準(2010版)進行判定。白斑面積參照VASI評分，VASI=(身體各部占手掌單元數的總和)×該區域色素脫失所占百分比，VASI值范圍為 0～100。色素積分評定:0分:病變皮膚呈乳白色或純白色，無任何色素沉著;1分:病變皮膚呈淡白色，或有少許色素沉著;2分:患者病變皮膚呈現淡褐色，或有多數色素島產生；3分:患者病變皮膚呈現黃褐色，接近正常膚色或正常膚色。

1.2.2.3氧化-抗氧化指標 兩組患者治療前后與健康組分別采用生化法檢測外周血血清MDA、SOD、CAT、GSH-Px水平，操作流程均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.2.4CD4+CD25+CD127LOW/-Treg指標 流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞中CD4+CD25+CD127LOW/-Treg占CD4+T 細胞的比例。操作流程：試劑平衡至室溫；試管相應編號：CD4、CD25、CD127；每管加相應的抗體5 μl/每種和50 μl全血，震蕩，室溫避光20 min。加血前搖勻血樣；加入溶血素1 ml，振蕩后室溫避光10 min；離心，1 500 r/min 5 min，棄上清振蕩，加入PBS洗液2 ml，震蕩離心1 500 r/min 5 min，棄上清震蕩；加入PBS 500 μl，上機前4℃保存，上機，最后Beckman公司的Kaluza流式數據分析軟件進行數據分析。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，兩樣本符合正態分布、方差齊，組內比較用配對樣本t檢驗，組間比較用兩獨立樣本t檢驗。計數資料以率或者構成比表示，數據處理采用χ2檢驗，P<

2 結果

2.1臨床療效比較 觀察組治療后的總有效率(90.3%)顯著高于對照組(67.7%)，差異有統計學意義(χ2=6.292，P<0.05)。見表1。

2.2兩組患者治療前后白斑面積及白斑色素積分的變化 治療前兩組白斑面積比較無統計學意義(t=0.254，P>0.05)，治療后兩組白斑面積較治療前顯著改善(觀察組：t=4.568，P<0.01；對照組：t=2.059，P<0.05)，治療后與對照組比較差異有統計學意義(t=2.183，P<0.05 )；治療前兩組白斑色素積分比較無統計學意義(t=0.254，P>0.05)，治療后白斑色素積分顯著提高(觀察組：t=6.735，P<0.01；對照組：t=5.067，P<0.01)，治療后兩組比較有顯著性差異(t=2.304，P<0.05)。見表2。

2.3治療前后外周血氧化及抗氧化指標檢測結果 治療前：兩組患者血清MAD 水平較健康組顯著上升(觀察組:t=24.17;對照組:t=18.58，P<0.01)，SOD、CAT、GSH-Px水平較健康組顯著下降；治療后：兩組患者血清MAD 水平較治療前顯著下降，觀察組優于對照組(t=8.469，P<0.01)，血清SOD、CAT、GSH-Px水平較治療前顯著提高，觀察組均優于對照組(t1=5.846，t2=6.234，t3=6.152，P<0.01)。見表3。

2.4治療前后患者外周血CD4+T細胞中Treg細胞比例 利用流式細胞術細胞染色 Treg 細胞的標志性分子CD4、CD25、CD127LOW/-，通過在CD4+T 細胞中框選三陽性細胞占的比例，發現相較于正常健康組，觀察組和對照組治療前Treg 細胞的比例明顯降低，差異具有統計學意義(觀察組:t=13.77，P<0.01;對照組:t=13.20，P<0.01)，治療后Treg 細胞的比例明顯上升，觀察組優于對照組(t=6.894，P<0.01)。見圖1。

表1 觀察組與對照組療效比較[n(%)]

Tab.1 Comparison of clinical curative effect in two groups after treatment[n(%)]

GroupsnDevelopStableImprove76%-100%51%-75%26%-50%≤25%ExcellenceEfficiency(%)Observation313(9.6)5(16.1)3(9.7)7(22.6)6(19.4)7(22.6)10(32.3)31(90.3)1)Control3110(32.3)7(22.6)1(3.2)3(9.7)4(12.9)6(19.4)4(12.9)21(67.7)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

GroupsnVASI scoreBefore treatmentAfter treatmentPigment integral scoreBefore treatmentAfter treatmentObservation312.92±1.531.50±0.701)2)0.58±0.722.00±0.891)2)Control 312.66±1.741.94±0.961)0.52±0.681.45±0.851)

Note：Compared with the same group before treatment,1)P<0.01;compared with the control group after treatment,2)P<0.05.

GroupsnObservation pointMDA(nmol/ml)SOD(U/ml)CAT(U/ml)GSH-Px(U/L)Observation31Before treatment5.94±0.391)89.90±1.151)4.29±0.581)865.92±28.641)After treatment3.53±0.312)3)101.96±6.072)3)6.26±0.512)3)1 080.63±74.882)3)Control31Before treatment5.79±0.501)89.86±1.991)4.22±0.521)876.90±34.661)After treatment4.21±0.322)94.14±4.312)5.38±0.592)972.71±62.712)Health102.59±0.36111.49±2.797.22±0.341 165.42±62.17

Note：Compared with the healthy group before treatment,1)P<0.01;compared with the same group before treatment,2)P<0.01;compared with the control group after treatment,3)P<0.01.

圖1 流式細胞術檢測治療前后外周血CD4+T細胞中Treg細胞所占比例Fig.1 Proportion of Treg cells in CD4+T cells in peripheral blood before and after treatment was detected by flow cytometryNote:A.Before observation group;B.After observation group;C.Before control group;D.After control group;E.Health group.Compared with the healthy group before treatment,#.P<0.01;compared with the same group before treatment,*.P<0.01;compared with the control group after treatment,△.P<0.01.

圖2 治療前后靶皮損的對照Fig.2 Comparison of target skin lesions before and after treatmentNote:A.Large area of depigmentation can be seen in the left frontal and anterior hairline of the patient before treatment;B.More than 50% of the area was repigmentation after 8 weeks of treatment;C.After 3 months of treatment,the repigmentation was nearly 100%.

2.5治療前后靶皮損的對照 治療前患者面部左額、前發際線處可見邊界不規則的色素脫失斑，皮損區伴部分毛發變白；治療8周后皮損區復色50%以上，伴部分毛發色素的恢復；治療3個月后皮損區近100%的復色。見圖2。

3 討論

白癜風是臨床常見的色素脫失性皮膚病，以皮膚和黏膜進行性出現色素減退斑為臨床特征。發病率約為 0.5%～1%[8]，且呈逐年上升趨勢，目前FDA無明確的靶向治療藥物，一項大規模流行病學調查研究顯示[9]，大約 60%的患者發生于20歲前[10]，疾病呈年輕化、進行性發展的特點要求針對關鍵發病環節采取有效地預防和治療措施是皮膚病科丞待解決問題。

白癜風病因復雜，發病機制尚未完全闡明。較為公認的觀點，氧化應激是啟動白癜風發病的起始因素，相對于表皮其他細胞而言，黑素細胞尤其容易出現氧化應激,這是因為黑素細胞除了在同樣受到紫外線等外源性因素刺激下胞內會產生ROS以外，在其特有的黑素合成功能過程中也會產生大量ROS[10]。氧化應激啟動白癜風黑素細胞相關抗原或危險信號的釋放進一步誘導自身免疫發揮效應功能。其中，CD8+T細胞介導的細胞殺傷作用被認為是關鍵效應環節，多項小鼠及白癜風患者體內外的研究顯示，Treg 細胞數目及功能異常是CD8+T 細胞介導免疫損傷的重要原因，調節性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg cell)是 CD4+T 細胞中的一個亞型，具有調節效應T細胞功能,可以主動抑制其他T細胞的功能從而維持免疫穩態、預防自身免疫的發生[11]。Tregs與白癜風的發病密切相關，Tregs數量減少與功能異常導致白癜風患者免疫失衡，過度活躍的自身反應性T細胞攻擊機體內正常存在的黑色素細胞，造成其進行性功能喪失，進而造成皮膚色素脫失形成白斑[12]。部分研究表明，進展期白癜風或白癜風發病早期患者外周血中CD4+CD25+Treg 細胞比例顯著降低[13，14]，這與我們的研究結果一致，為Treg比值測定更加準確性，我們采用IL-7受體 CD127標記Treg，CD127在具有免疫抑制作用的CD4+CD25+Treg 細胞中呈低表達，此種Treg在MLR中具有抑制同源激活T細胞的能力，并在相同刺激下無自身作用，較Foxp3標記更具優勢[15]，我們發現治療前白癜風患者的外周血CD4+CD25+CD127LOW/-Treg細胞數目明顯降低，治療后皮損癥狀得到改善，外周血Treg細胞數目較治療前明顯上升。Chatterjee等[16]在黑素瘤小鼠模型中發現 Treg 細胞缺失時出現小鼠毛發的脫色，證實Treg細胞缺如導致黑素細胞特異性 T 細胞功能亢進，殺傷正常黑素細胞，另相關體內實驗表明過繼轉移 Treg 細胞后可使白癜風小鼠模型脫色的毛發復色。Visseren等[17]研究發現，健康人體內同樣存在黑素細胞特異性CD8+T細胞，卻不會導致白癜風的發生，提示白癜風患者體內具有免疫監控作用,Treg細胞可能受損，從而效應性T細胞的活性不能被有效抑制，進一步提示Treg細胞在阻止白癜風發展中具有重要作用。將白癜風抗氧化分子HO-1與Treg細胞免疫功能狀態聯系起來，發現白癜風患者HO-1活性降低是黑素細胞氧化應激損傷的重要原因[18]，為白癜風氧化應激啟動黑素細胞自身免疫反應白癜風發病提供了新的證據，因此調節機體的氧化-抗氧化失衡促進Treg細胞分化為白癜風的治療提供一個新思路。

補烏煎劑是我科的協定方，聯合308 nm準分子治療白癜風療效肯定，308 nm準分子起效快，可以誘導機體產生多種細胞因子，刺激表皮增強毛囊外毛根鞘部位黑素細胞增殖分化活動，形成更多黑素細胞，并輸送到病變部位促進色素的恢復[19]，聯合中藥治療進展期白癜風可以達到縮短病程，提高患者治療的信心從而提高患者的依從性。基于中藥治療白癜風“色相”理論，同時兼顧現代醫學公認的白癜風發病與患者自身免疫之間的密切關系，中藥治療白癜風的共性是“補益肝腎”，考慮到進展期關鍵因素為“風”、“瘀”，正如《素問·風論》所云“風氣藏于皮膚之間，內不得通，外不得泄”。 其病機關鍵乃氣血失和，脈絡瘀阻；兼夾風邪，累及肝腎；補烏煎劑組方配伍補益肝腎與祛風疏肝之品同用，且兼顧活血化瘀之特點，具有補益肝腎而不滯，祛風而不燥，養血潤膚而不留淤之優點。方中補骨脂、烏梅補益肝腎，收澀生津為君藥；女貞子、旱蓮草、菟絲子助君藥加強補益肝腎的作用為臣藥，女貞子、旱蓮草滋腎陰藥與補骨脂、菟絲子溫補腎陽同用可以陰陽互生，使得“陰得陽助則源泉不竭，陽得陰助則生化無窮”。白蒺藜、郁金、香附、自然銅祛風疏肝，丹參、桃仁活血化瘀為佐藥。從現代藥理學層面，補骨脂、烏梅、旱蓮草、女貞子、菟絲子、刺蒺藜具有抗氧化、調節免疫作用從而保護黑素細胞免受氧化應激的損傷[20-23]，激活酪氨酸酶活性、增強光敏感性從而促進黑色素的生成[24]；郁金能夠抗自由基的損傷，且具有類似糖皮質激素樣作用從而抑制黑素細胞的損傷,香附黃酮具有較強的抗氧化活性，對自由基有較強的清理能力,其清除率隨著香附黃酮提取物濃度的增加而增加[25]；桃仁、丹參能夠改善微循環，清除氧自由基及炎性因子，有利于改善組織細胞的新陳代謝，刺激黑素細胞黑素合成、上調酪氨酸酶活性促進黑素細胞再生[26]；自然銅中富含微量元素銅離子是自由基清除劑SOD活性中心之一，且直接參與人體色素的代謝過程，含銅酶-酪氨酸酶催化酪氨酸轉化為多巴，進而促進黑色素的合成[27]。綜上，補烏煎劑中藥復方的“協同”作用可通過抗氧化、抑制免疫反應，激活絡氨酸酶的活性、促進黑素細胞的增殖等多個環節對進展期白癜風的治療產生較好的療效。

目前，白癜風治療主要目標是控制疾病的進展，促進色素脫失部位盡快恢復色素。我們研究表明補烏煎劑聯合308準分子光治療進展期白癜風可以明顯降低白癜風的VASI評分達到控制疾病進展的作用，同時增加白斑的復色促進色素的恢復。我們通過外周血相關指標觀察到補烏煎劑聯合308準分子光組較對照組比較，可明顯提高機體的抗氧化水平調節機體的氧化-抗氧化失衡狀態，同時可以提高Treg細胞在CD4+細胞中的比例從而抑制CD8+細胞的免疫攻擊發揮治療作用，但氧化應激-細胞免疫-白癜風之間具體的網絡關系需要進一步的細胞實驗觀察探討。