四川地區新生兒G6PD缺乏癥篩查及確診情況分析

周婧瑤，張 鈺，胡 琦，陳雪蓮，楊麗涓，蘇星月，歐明才

(四川省婦幼保健院，四川 成都 610045)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏癥是最常見的人類酶缺陷遺傳病之一，該病常在某些誘因(食用蠶豆、藥物，感染)下發病，臨床表現為急性溶血性貧血及高膽紅素血癥，是新生兒病理性黃疸的主要原因，嚴重時可導致核黃疸，造成智力低下，甚至死亡[1]，成為影響人口素質的重要問題之一。四川省新生兒篩查中心于2014年12月開始面向全省開展新生兒G6PD缺乏癥篩查及確診工作，現對篩查情況和基因突變類型進行分析，以便為進一步提高本地區的人口素質和規范新生兒疾病篩查的管理水平及完善有效的干預措施提供決策依據。

1研究對象與方法

1.1研究對象

本研究樣本來源于四川省新生兒篩查中心片區市縣醫療機構的新生兒遺傳代謝病篩查資料。2014年12月至2017年12月共計篩查新生兒229 091例，其中男118 651例，女110 440例。

1.2研究方法

1.2.1 G6PD缺乏癥新生兒篩查

在新生兒監護人知情同意的情況下，新生兒于出生72小時并充分哺乳6次后，由培訓合格的專業醫務人員取其足后跟血，制成干血斑，通過郵政快遞送至新生兒篩查實驗室集中檢測。采用G6PD熒光定量分析法(芬蘭Ani labsystems公司新生兒G6PD檢測試劑盒，芬蘭Ani labsystems公司BIOTEKFLX-800熒光分析儀)進行G6PD酶活性測定。以G6PD<2.8U/g血紅蛋白為篩查陽性標準。

1.2.2 G6PD缺乏癥酶學診斷

召回篩查陽性的可疑患兒，采集其靜脈血2mL(乙二胺四乙酸抗凝)，測定紅細胞G6PD酶活性(奧林巴斯AU2700全自動生化分析儀，寧波美康生物科技公司的連續監測速率法)，當紅細胞G6PD<1 700U/L(兒童正常參考值1 700～2 600U/L)診斷為G6PD缺乏癥。

1.2.3 G6PD基因熱點變異分析

采用廈門致善生物科技股份有限公司Lab-Aid820核酸提取Micro試劑及核酸提取儀對初篩陽性患兒的干血斑樣本DNA進行提取。采用熒光PCR熔解曲線技術(廈門致善生物科技股份有限公司G6PD基因突變檢測試劑盒及熒光定量PCR)進行G6PD基因12種中國人熱點變異(c.95A>G，c.383T>C，c.392G>T，c.487G>A，c.517T>C，c.592C>T，c.871G>A，c.1004C>A，c.1024C>T，c.1360C>T，c.1376G>T，c.1388G>A)定性檢測。

1.2.4 G6PD基因直接測序

利用Sanger測序對初篩陽性但基因熱點變異分析陰性的高度疑似G6PD缺乏癥的樣本進行序列分析，進一步明確是否存在非熱點變異。

1.3比較指標

統計所檢測標本中各型突變的比例，以了解本地區G6PD基因熱點突變的分布情況；根據基因診斷陽性、陰性樣本的酶學法檢出率，以評價基因診斷與酶學診斷兩種方法在G6PD診斷中的應用。

2結果

2.1 G6PD缺乏癥新生兒篩查情況分析

229 091例新生兒干血斑G6PD酶活性中位數為8.79U/g血紅蛋白。最小為0，最大為30.60U/g血紅蛋白。以G6PD<2.80U/g血紅蛋白為陽性切值，共檢出陽性1 169例，其中男1 028例，女141例，男：女為7.3∶1，G6PD缺乏癥新生兒篩查陽性率為0.51%，其中男性為0.87%(1 028/118 651)，女性為0.13%(141/110 440)。在初篩檢出的陽性病例中，有206例患者進行了基因診斷，276例進行了G6PD酶學診斷，182例同時進行了G6PD酶學診斷與基因診斷，另外505例為失訪患者。

2.2 G6PD缺乏癥新生兒篩查陽性的基因診斷

2.2.1基因熱點變異分析

在篩查陽性高危患兒中，182例(男153例、女29例)通過基因熱點變異檢測進行確診。在153例男性新生兒中檢出122例半合子變異，男性G6PD缺乏癥篩查陽性與G6PD基因熱點變異診斷符合率為79.74%(122/153)。在29例進行G6PD基因熱點變異分析的女性新生兒中，有9例檢出變異，女性G6PD缺乏癥篩查陽性與G6PD基因熱點變異診斷符合率為31.03%(9/29)。

2.2.2 G6PD基因測序

對51例(男31例，女20例)篩查陽性但熱點變異檢測陰性的高度疑似患兒的樣本進行G6PD基因測序。在31例未檢出熱點變異的男性新生兒中，發現5例存在4種半合子變異類型，分別為2例c．406C>T、1例c.703C>T、1例c.835A>T及1例c.1311C>T變異，均為已知致病變異，其余26例男性及20例女性均未檢出異常。

2.2.3 G6PD缺乏癥基因變異特點及患病率

在上述進行基因檢測的182例篩查陽性者中，通過熱點變異共檢出9種變異，分別為c.1004C>A 2例、c.1024C>T 19例、c.1376G>T 46例、c.1388G>A 34例、c.487G>A 4例、c.517T>C 1例、c.871G>A 10例、c.95A>G 10例、c.392G>T 5例。結合G6PD基因測序結果，共檢出136例G6PD基因變異，變異類型13種，四川地區G6PD基因變異率為74.73%(136/182)，男性新生兒為83.01%(127/153)，女性新生兒為31.03%(9/29)。根據基因變異檢出率推測，四川地區G6PD缺乏癥男性患病率約為0.72%(853/118 651)，女性約為0.04%(44/110 440)。

2.3酶學診斷與基因診斷的數據分析

本研究同時運用了G6PD酶學診斷方法對182例篩查陽性的高危患兒進行了酶活性檢測，分別統計基因診斷陽性、陰性樣本的酶學法檢出率，作為酶學診斷與分子診斷兩種方法比較的依據。在G6PD基因診斷中共檢出陽性136例，其中酶活性陽性者123例(男119例，女4例)，酶活性正常者13例(男8例，女5例)；在46例基因診斷未檢出異常者中，酶活性陽性者21例(男17例，女4例)，酶活性正常者25例(男9例，女16例)。與G6PD基因診斷方法比較，G6PD酶學診斷的敏感度為90.44%(123/136)，男性新生兒為93.70%(119/127)，女性新生兒為44.44%(4/9)；陽性預測值為85.42%(123/144)，男性新生兒為87.50%(119/136)，女性新生兒為50.00%(4/8)。

3討論

3.1篩查情況分析

G6PD缺乏癥是人類最常見的單基因遺傳病之一。據統計，該病在全球約有3.5億例患者，其分布與瘧疾的選擇性有關，主要分布于熱帶、亞熱帶地區，在我國呈“南高北低”的分布特點，患病率為0.20%～44.80%[2]。該病主要以預防為主，而如何在人群中進行科學有效的篩查就成為預防工作的重點。本研究通過熒光分析法，對229 091例新生兒干血斑G6PD酶活性進行定量測定，篩查陽性率為0.51%，根據基因變異檢出率推測，四川省G6PD缺乏癥男性新生兒患病率約為0.72%，女性新生兒約為0.04%，雖遠低于廣東(3.70%)、廣西(7.40%)等高發地區[3]，但與四川省新生兒疾病篩查的先天性甲狀腺功能低下癥(CH)及苯丙酮尿癥(PKU)的患病率相比(PKU為1∶16 488,CH為1∶2 339)，該病仍屬于四川地區的高發病種之一，因此，本研究從新生兒篩查角度探討四川地區G6PD缺乏癥的遺傳學特征，并以基因診斷為依據，評估現有的新生兒篩查和酶學診斷的性能，為衛生行政部門提供決策依據。

3.2基因情況分析

G6PD基因定位于X染色體上，以X染色體連鎖不完全顯性方式遺傳，因基因突變導致紅細胞G6PD酶活性降低而發病[4]。本研究通過分子診斷的方法，共檢出13種變異類型，所有變異均為已知變異，其中5種常見變異為c.1376G>T、c.1388G>A、c.1024C>T、c.95A>G、c.871G>A，共占檢出變異位點的90.84%，主要以c.1388G>A、c.1376G>T及c.1024C>T為主，占總比例的76.34%，其次是c.871G>A及c.95A>G。c.1388G>A基因突變率高于c.1376G>T突變率，成為四川地區的主要基因突變類型，且本研究結果顯示c.95A>G并非為本地區最常見的3種G6PD基因突變類型之一，這與蔡望偉、楊昭慶等相繼于2001年對廣東、廣西、云南、貴州、海南、臺灣的報道以及余超等[5]對重慶地區的報道存在差異，說明不同地區不同人群的G6PD基因突變譜不同，提示我省應根據自己的基因突變譜制訂突變熱點檢測的納入范圍，并將高發位點作為重要的突變熱點進行檢測。

3.3確診方法比較

G6PD缺乏癥男性患者為半合子，基因突變攜帶者即為患者，表現為G6PD酶重度缺乏，通過酶活性檢測很容易查出[6]。本研究通過酶學診斷男性新生兒的敏感度為93.70%，是女性新生兒的2.1倍，該結果與其他篩查中心[7]報道的G6PD熒光斑點法篩查陽性率和診斷符合率結果基本一致，提示酶學檢測用于男性患兒診斷的靈敏性及特異性均很高。

由于該病的遺傳特點，女性患兒可發生兩條X染色體上的G6PD同時突變或其中一條隨機失活的情況，因此，酶缺乏的紅細胞與正常紅細胞嵌合的比率存在差異，體內酶活性可呈現顯著降低，也可以在正常范圍內。本研究女性新生兒的酶學診斷與基因診斷相比，陽性預測值僅為50.00%，證明分子診斷的敏感性更高，通過基因檢測可明顯提高女性患兒的檢出率，降低女性雜合子的漏檢率。雖然G6PD酶活性正常的女性攜帶者無臨床表現和自身患病風險，但可將致病性突變遺傳給子代，增加子代新生兒早期高膽紅素血癥及急性溶血風險，提高女性攜帶者檢出率對指導遺傳咨詢具有一定的指導意義。

對于本研究中的21例酶活性異常但基因檢測未見突變位點的患兒，考慮存在因其他病因造成的G6PD酶活性繼發性異常或存在未知新的基因突變位點的可能，后期應繼續跟蹤隨訪，有待進一步研究原因。

綜上所述，目前我省開展的新生兒G6PD缺乏癥篩查及診斷的檢查工作是具有可行性的，對于患兒的早期診斷及有效干預意義重大。酶學檢測方法簡單、快速，可作為男性患兒的確診依據；女性雜合子因酶活性變化較大，酶學診斷的檢出率低，因此，為防止女性患兒的漏診，建議開展新生兒G6PD缺乏癥的分子診斷。后期應進一步分析突變熱點與酶活性的相關性，以便根據不同檢測對象，選用合理的診斷方法，實現最高效地檢出陽性患兒。