內皮型一氧化氮合酶與血栓性疾病的研究進展

蔣慶娟應燕萍

(廣西醫科大學第一附屬醫院,南寧 530021)

血栓性疾病是由血栓形成和血栓栓塞兩種病理過程引起的,其發病率高居各種疾病之首,且有漸增之勢,在全球人口死亡原因中位列第一[1],是當代醫學研究的重點和熱點之一。一氧化氮(nitric oxide,NO)是由血管內皮細胞產生并釋放的內皮依賴性舒血管因子,具有舒張血管、抑制血小板黏附聚集,防止血栓形成等作用,是保護血管壁的重要生物活性物質[2]。NO由一氧化氮合酶(nitric oxide synthases,NOS)催化底物L-精氨酸而生成。哺乳動物中,NOS具有3種同工酶,即神經元型、誘導型和內皮型,血液中的NO主要來源于內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthases,eNOS)[3]。有研究顯示,eNOS與血栓性疾病有密切關系,參與急性冠狀動脈綜合征、心房顫動、腦卒中、肺血栓栓塞癥和深靜脈血栓形成等血栓性疾病的發生、發展和預后。近年來,有關eNOS的研究層出不窮并深入到基因和蛋白組學水平。本文主要就eNOS的結構和生理功能,及其參與血栓性疾病的機制和研究進展進行綜述。

1 eNOS的結構和特性

編碼人類eNOS的基因位于第7號染色體7q35-36上,對應的mRNA全長為4345 bp,包括26個外顯子,25個內含子,跨度21 kb,翻譯后可生成1203個氨基酸蛋白產物[4]。據報道eNOS存在基因多態性位點,目前關于G894T(位于第7外顯子)、27 bpVNTR(位于第4內含子)和T786C(位于啟動子區域)等位點的研究居多[5-6]。eNOS的確切細胞定位尚不清楚,可能存在于高爾基體,質膜和質膜小凹。eNOS作為一種鈣依賴性酶,它由分子量大小約為134×103的兩個相同單體組成的二聚體,eNOS只有以二聚體的形式起作用。eNOS單體具有兩個功能不同的結構域,分別是包含催化位點的N端氧化酶結構域和C端還原酶結構域。BH4、L-精氨酸和血紅素的結合位點位于其N端,黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)、黃素單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)和鈣調蛋白(calmodulin,CaM)的結合位點位于其C端[7]。eNOS的二聚化始于血紅素的結合,若無血紅素,eNOS酶則僅以單體形式存在,不具有活性。血紅素的結合和二聚體的形成使四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)與eNOS二聚體結合成為可能,從而形成穩定的二聚體。

較多學者認為,現有證據表明,eNOS活性受其兩個固有的屬性調控。一個生化特征是甘氨酸-2的豆蔻酰化和半胱氨酸-15/半胱氨酸-26的棕櫚酰化,使eNOS定位于質膜小窩,與質膜表面標記蛋白即小窩蛋白(CaveoliN-1,Cav-1)結合[8],通過干擾CaM結合和電子轉移至血紅素亞基而抑制eNOS活性。eNOS的另一個分子特征是在還原酶結構域的C-末端存在大約50個氨基酸序列,這阻礙了CaM與CaM結合位點的結合[9]。eNOS的鈣依賴性表明它的活性受到Ca2+濃度的調控,當細胞內Ca2+水平的升高時,可誘導Ca2+/CaM復合物的形成,促進鈣調蛋白與二聚體結合,并與Cav-1解離,激活eNOS,最終使NO生成增加。

2 eNOS的功能

2.1 舒張血管和抑制血小板聚集

eNOS是心血管功能的體內穩態調節劑,能通過刺激可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)并增加平滑肌細胞中的環磷酸鳥苷(cyclic guanosinc monophosphate,cGMP)來舒張所有類型的血管[10]。sGC在NO信號轉導通路中起重要作用,是信號轉導的關鍵,也是 NO的唯一受體[11]。抑制eNOS會顯著增強血小板聚集的程度和持續時間,且血流剪切力可使eNOS磷酸化,促進NO釋放,起到抑制血小板聚集的作用[7]。Moore等人[12]認為這種功能是通過對血小板的直接作用來介導而非血管張力變化,但尚不清楚具體機制。血小板聚集減少除了能防止血栓形成外,還可以防止血小板衍生生長因子的釋放,對適應慢性血流變化的血管重塑有重要意義[13]。

2.2 抑制白細胞粘附和血管炎癥

單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant proteiN-1,MCP-1)是一種炎性細胞因子,與炎癥反應和組織損傷有關,當機體發生炎癥或損傷時可使單核巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞聚集并活化[14]。研究表明,eNOS能降低MCP-1的表達,并通過干擾白細胞粘附分子CD11/CD18與內皮細胞表面結合的能力,抑制白細胞CD11/CD18的表達,抑制白細胞粘附于血管壁[15]。血小板和白細胞對內皮細胞的粘附被認為是動脈粥樣硬化發生的早期事件[16],因此推測eNOS可能有預防動脈粥樣硬化發生的作用。此外,eNOS還可預防由促炎癥細胞因子和促動脈粥樣硬化因子誘導的內皮細胞凋亡,從而有助于發揮抗炎癥和抗動脈粥樣硬化作用[17]。

2.3 控制血管平滑肌增殖

已顯示eNOS可抑制血管平滑肌細胞的DNA合成、有絲分裂和增殖,且這種抗增殖作用可能是由cGMP介導的[18]。如前所述,eNOS有抑制血小板聚集的作用,這種作用可保護平滑肌免受血小板衍生生長因子的影響,故這也阻止了動脈粥樣硬化的后續步驟,即纖維斑塊的形成。基于這些效應的組合,eNOS衍生的NO可以被認為是一種抗動脈粥樣硬化的原理。

2.4 激活內皮祖細胞,刺激血管生成

eNOS在血管生成中扮演關鍵角色,介導血管生成因子下游信號,并受miR-92a和Sphk1/S1P信號傳導影響[19-20]。miR-92a上調可激活eNOS/NO信號通路受體,誘導內皮祖細胞遷移,促進血管生成[21]。eNOS基因敲除小鼠表現出血管生成受損,這與內皮祖細胞動員的缺陷有關,可見eNOS的表達影響著內皮祖細胞的募集[22]。丹紅注射液、沙格列汀等藥物均是通過涉及eNOS信號的級聯反應,動員內皮祖細胞以修復血管內皮損傷[23-24]。朱艷含等[25]學者證實,eNOS的磷酸化能促進內皮祖細胞的釋放,改善血管生成。

3 eNOS與血栓性疾病

3.1 急性冠狀動脈綜合征

急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或侵襲,繼發完全或不完全閉塞性血栓,阻塞冠狀動脈為病理基礎的一組臨床綜合征,包括急性ST段抬高性心肌梗死、急性非ST段抬高性心肌梗死和不穩定型心絞痛[26]。有研究發現,eNOS G894T的T等位基因和T786C的C等位基因與ACS存在關聯[27],這些位點突變后會進一步增加心肌梗死風險[28]。eNOS敲除小鼠身上可以看到內膜增厚,脂質沉積增加,動脈粥樣硬化病變加速[29],在動脈粥樣硬化患者中也觀察到eNOS的 mRNA表達和蛋白表達均降低[30],斑塊破裂后會暴露在內皮細胞下,從而激活血小板和凝血級聯反應,最終導致血栓形成[31]。血小板聚集、白細胞粘附、平滑肌細胞增殖均有利于動脈粥樣硬化的發展,而eNOS有抑制血小板和白細胞粘附的作用,可減少細胞凋亡,保護血管平滑肌免受血小板衍生生長因子的影響,被認為是抗動脈粥樣硬化的原理。

3.2 腦卒中

腦卒中(stroke)具有“四高”特點,即發病率高、死亡率高、致殘率高、復發率高,已成為我國首要致死、致殘病因,而在美國每4 min就有1人死于腦卒中[32-33]。2016年全球疾病負擔數據顯示[34],我國缺血性腦卒中和出血性腦卒中發病率分別為276.75/10萬、126.34/10萬。目前已有多項報道證實eNOS基因多態性與腦卒中的發生有關,G894T多態性可改變eNOS在小窩上的定位,破壞酶調節周期,使eNOS蛋白容易被分解,影響NO生成[35]。但進一步的調查發現,eNOS基因在不同種族間結果略有不同。一項臺灣的病例對照研究發現[36],eNOSGlu298Asp和 Cav-1的G14713A、T29107A基因多態性對腦卒中的風險增加有協同作用。而eNOSG894T和T786C的位點突變會使韓國人易患缺血性腦卒中,但在高加索人群中T786C被認為是保護因素[37]。另有薈萃分析表明,eNOS的4A4B基因多態性與亞洲人腦卒中有關[38]。因此,未來還需要更多不同種族的研究以驗證eNOS基因多態性與腦卒中的關聯。

3.3 心房顫動

心房顫動(atrial fibrillation,AF,簡稱房顫)是臨床上一種常見的心律不齊,以心房快速不規則跳動為特征,血栓栓塞是其最嚴重的合并癥[39]。大量研究證實,eNOS對調節心肌功能,維持心肌Ca2+穩態,松弛和可擴張性以及防止心律不齊和異常應激刺激非常重要。AF時可引發心房出現湍流,混亂的心房收縮會降低eNOS表達,削弱其舒張功能,導致內皮功能障礙[40]。心房重構是房顫的重要病理生理變化,房顫會使心肌組織eNOS mRNA和蛋白表達均下調,并認為這可能是心房結構重構,心房血栓形成的原因。在房顫豬模型中觀察到心內膜eNOS的表達顯著減少,NO在心房組織中的生物利用度下降[41]。同樣地,在房顫患者中也發現與竇性心律患者相比,房顫患者的eNOS蛋白表達水平降低(P＜0.05)[42]。此外,eNOS表達上調,血管 NO釋放增加還可以降血管緊張素轉化酶的表達與活性,抑制血管收縮,減少房顫發生率[43]。

3.4 深靜脈血栓

深靜脈血栓(deep vein thrombosis,DVT)好發于腿部和骨盆的深靜脈,肺栓塞是其致死性并發癥之一,嚴重危害人類健康[44]。美國心臟協會的報告指出,在美國每年就有約200萬人患DVT,其中10%的患者死于肺栓塞[45]。據推測,eNOS多態性(RS1799983)與骨科手術后深靜脈血栓形成的易感性有關,eNOS突變可能通過影響內皮細胞中NO的產生和血管穩態而參與 DVT的發展[46]。RS1799983位于編碼區的c.894,c.894G/T分別對應eNOS蛋白298位的谷氨酸和天冬氨酸。與谷氨酸相比,天冬氨酸的eNOS蛋白不穩定。因此,T等位基因會導致eNOS蛋白功能降低,進而導致內皮細胞NO合成減少,最終增加DVT的風險。Zhao等人[47]對涉及8808例受試者的17項研究進行Meta分析,其結果提示eNOSG894T多態性與亞洲人群發生DVT有密切聯系。DVT患者eNOS較正常組患者在血清中的表達下調,被認為是與DVT形成相關的候選蛋白[48]。另有動物實驗發現[49],經NO微泡靜脈注射治療后大鼠DVT的重量與長度明顯減少。可見,體內NO水平的升高有助于DVT溶解。

4 小結與展望

綜上,大量實驗表明eNOS參與血栓性疾病的發生發展,其具有舒張血管、抑制血小板黏附聚集,防止血栓形成等作用,是研究血栓性疾病易感性的候選基因,防治血栓性疾病的關鍵。有關eNOS與血栓性疾病發病和治療機制的深入研究具有重大理論和實際意義,相關基因可能成為治療血栓性疾病的新靶點。但當前,對于eNOS多態性與血栓性疾病的研究結果因不同人群存在爭議,未來還需要更多不同種族人群的大型研究加以驗證。