miR-22-3p靶向負(fù)調(diào)控eIF4E對(duì)兒童骨肉瘤細(xì)胞增殖影響的研究

姚紅月，李 巖，陳美雪，王金鳳△

1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科(錦州121000)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科(錦州121000)

骨肉瘤好發(fā)于兒童和青少年，病變進(jìn)展快，部分患者預(yù)后差。腫瘤細(xì)胞呈高增殖狀態(tài)[1]。近年研究顯示分子遺傳學(xué)的異常參與病變的形成和進(jìn)展[2]。真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eIF4E)是一種帽結(jié)合蛋白，能特異性地識(shí)別mRNA的5’端的帽子結(jié)構(gòu)，近年研究顯示其異常表達(dá)參與腫瘤的形成[3]，目前其調(diào)控通路研究較少。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年關(guān)注的與腫瘤形成有關(guān)的因子，是19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA，miRNA在發(fā)揮生物學(xué)作用時(shí)主要是通過調(diào)控下游靶基因?qū)崿F(xiàn)[4]。我們應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，選擇與骨肉瘤密切相關(guān)、且文獻(xiàn)中罕見報(bào)道的miR-22-3p進(jìn)行研究，同時(shí)應(yīng)用RNA22預(yù)測到eIF4E可能是miR-22-3p的靶因子。基于此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用前瞻性研究，檢測骨肉瘤細(xì)胞系SAOS-2和骨肉瘤組織中miR-22-3p的表達(dá)，分析miR-22-3p和eIF4E的靶向關(guān)系及對(duì)兒童骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用。

資料與方法

1 一般資料 選擇2017年1月至2019年6月在我院確診為兒童骨肉瘤并行手術(shù)治療的27例作為觀察對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①由病理醫(yī)師確診，符合WHO中的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次確診并進(jìn)行手術(shù)治療；③臨床及病理資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其它器官惡性腫瘤；②術(shù)前行放、化療；③診斷有異議者。本組年齡3～14歲，平均年齡7.3歲，其中男15例，女12例。患者或家屬均簽訂知情同意書。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞系：人骨肉瘤細(xì)胞系SAOS-2和成骨細(xì)胞系OB-3購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。由DMEM完全培養(yǎng)基均勻接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，接種在12孔板，細(xì)胞密度調(diào)至3×105個(gè)/孔。采用Lipofectamine 2000試劑盒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。設(shè)置空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組、miR-22-3p轉(zhuǎn)染組、miR-22-3p和eIF4E共轉(zhuǎn)染組，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 雙熒光素酶基因?qū)嶒?yàn)：構(gòu)建eIF4E的3’UTR基因序列及雙熒光報(bào)告基因表達(dá)的載體。構(gòu)建3’UTR突變的雙熒光報(bào)告基因載體作為對(duì)照。將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞按70%的匯合度接種，培養(yǎng)16 h后，共轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒及miR-22-3p模擬物，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，48 h后，避光裂解細(xì)胞，檢測熒光素酶表達(dá)，判斷miR-22-3p能否與eIF4E的3’UTR結(jié)合。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)：miR-22-3p的表達(dá)均應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)法檢測。引物由蘇州睿贏生物技術(shù)公司合成，miR-22-3p上游：5’-GTCACATATCCGTCATCAC-3’；下游引物：5’-GACAACCACAGTTCAGTCTAC3’。U6(內(nèi)參)上游：5’-GGAACAGAGAAAGATTAGC-3’，下游：5’-TTGGAATTCACGAATTCCG-3’。首先提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)合成cDNA。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 20 s，64℃ 25 s，72℃ 20 s，10個(gè)循環(huán)；93℃ 25 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法計(jì)算相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平。ΔΔCt=[Ct目的基因(樣品-CtGAPDH(樣品]-[Ct目的基因(校正樣品-CtGAPDH(校正樣品]。

2.5 免疫組化實(shí)驗(yàn)：骨肉瘤組織中eIF4E和Ki67的表達(dá)應(yīng)用免疫組化SP法檢測。基于石蠟包埋組織。eIF4E和Ki67購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，DAB顯色。eIF4E的表達(dá)部位是細(xì)胞質(zhì)，Ki67的表達(dá)部位是細(xì)胞核，選擇5個(gè)400倍視野(熱點(diǎn)區(qū))，計(jì)算陽性率，取平均值。

2.6 Western Blot實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用Western Blot方法檢測各組PCNA的表達(dá)。首先提取總蛋白，嚴(yán)格按步驟操作，經(jīng)半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，顯影，拍照。以目的蛋白與GAPDH的比值作為定量結(jié)果，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析。

2.7 CCK-8法檢測細(xì)胞活性：應(yīng)用CCK-8法檢測各組不同時(shí)點(diǎn)(1～5d)的細(xì)胞活性。用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處吸光值，細(xì)胞活力計(jì)算公式：細(xì)胞活力(%)=(Absample-Abbland)/(Abcontrol-Abbalnd)×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，行t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同細(xì)胞系中miR-22-3p 表達(dá)的比較 骨肉瘤細(xì)胞系中miR-22-3p的表達(dá)量(1.03±0.18)明顯低于成骨細(xì)胞系OB-3(2.19±0.17)(t=3.64，P=0.005)(圖1)。

圖1 不同細(xì)胞系中miR-22-3p 表達(dá)的比較

2 eIF4E mRNA的3’UTR是miR-22-3p的直接靶點(diǎn) 構(gòu)建含有野生型eIF4E mRNA 3’-UTR序列的pGL3-basic質(zhì)粒(pGL3- eIF4E-WT)和miR-22-3p結(jié)合位點(diǎn)缺失的突變型eIF4E mRNA 3’-UTR序列的質(zhì)粒(pGL3- eIF4E-MT)，分別與空白對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組、miR-22-3p轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞培養(yǎng)24 h，通過雙熒光報(bào)告系統(tǒng)試劑盒檢測熒光素酶的表達(dá)。結(jié)果顯示miR-22-3p轉(zhuǎn)染組能引起轉(zhuǎn)染pGL3- eIF4E-WT的細(xì)胞中熒光素酶活性降低，而pGL3- eIF4E-MT組熒光素酶活性無改變，提示miR-22-3p可以與eIF4E的3’UTR有效結(jié)合。

3 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用CCK-8檢測1～5 d的細(xì)胞活性。與空白對(duì)照組及空載體轉(zhuǎn)染組比較，自第2天開始，miR-22-3p轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活性明顯下降，持續(xù)至第5天。但miR-22-3p和eIF4E共轉(zhuǎn)染組能改變細(xì)胞活性下降的現(xiàn)象(圖2)。

圖2 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(CCK-8法)

4 PCNA表達(dá)結(jié)果 與空白對(duì)照組及空載體轉(zhuǎn)染組相比，miR-22-3p轉(zhuǎn)染組中PCNA表達(dá)下降，miR-22-3p和eIF4E共轉(zhuǎn)染組能改變PCNA表達(dá)下降的現(xiàn)象。

5 miR-22-3p在骨肉瘤不同臨床病理特征中表達(dá)的比較 miR-22-3p在骨肉瘤中的表達(dá)量為0.63～1.92，平均值為(1.22±0.24)。miR-22-3p在不同腫物最大徑和病理分級(jí)的分組中差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同性別、年齡的分組中差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1(圖3)。

表1 miR-22-3p在不同臨床病理特征分組中表達(dá)的比較

圖3 miR-22-3p在骨肉瘤中的表達(dá)

6 骨肉瘤中miR-22-3p、eIF4E和Ki67的相關(guān)性分析 免疫組化方法檢測eIF4E陽性率范圍是8%～80%，平均為39.2%(圖4)，Ki67的陽性率范圍是10%～95%，平均為46.5%(圖5)。相關(guān)分析顯示miR-22-3p與eIF4E(r=-0.46,P=0.014)、miR-22-3p與Ki67 (r=-0.56,P=0.002)均呈負(fù)相關(guān)性，eIF4E與Ki67呈正相關(guān)性(r=0.49,P=0.023)。

圖4 eIF4E的表達(dá)(免疫組化SP法×200)

圖5Ki67的表達(dá)(免疫組化SP法×100)

討 論

骨肉瘤發(fā)生機(jī)制中涉及多種分子生物學(xué)通路，兒童骨肉瘤具有高增殖的特征。其中近年關(guān)注到miRNAs的異常表達(dá)對(duì)腫瘤的進(jìn)展有促進(jìn)作用。miR-22-3p是我們篩選出來的，其異常表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有一定的調(diào)節(jié)作用[5]。有資料顯示miR-22-3p在人體正常的組織和細(xì)胞中具有一定的表達(dá)量，而在惡變的細(xì)胞常伴有miR-22-3p表達(dá)的下調(diào)[6-7]。miR-22-3p下游基因較多，包括增殖相關(guān)基因、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等。eIF4E與腫瘤關(guān)系密切。eIF4E可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖活性增加，同質(zhì)型粘附能力下降，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增加，侵襲和遷移能力增強(qiáng)，因此eIF4E發(fā)揮的是癌基因樣作用，研究eIF4E 的調(diào)控因素可能有重要價(jià)值[8-9]。

本研究結(jié)果顯示骨肉瘤細(xì)胞系中miR-22-3p的表達(dá)明顯低于成骨細(xì)胞系，提示miR-22-3p低表達(dá)是重要的腫瘤事件。雙熒光素酶基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)miR-22-3p能引起轉(zhuǎn)染pGL3- eIF4E-WT的細(xì)胞系中熒光素酶活性顯著降低，提示miR-22-3p與eIF4E具有靶向關(guān)系，即eIF4E是miR-22-3p下游的重要靶點(diǎn)。此結(jié)果與Lv等[10]在宮頸鱗癌中觀察到的MiR-22-3p 與eIF4EBP3的靶向關(guān)系相一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-22-3p轉(zhuǎn)染組的骨肉瘤細(xì)胞活性明顯下降，PCNA表達(dá)下降，而共轉(zhuǎn)染組均能逆轉(zhuǎn)上述表達(dá)水平，提示miR-22-3p/eIF4E對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖有重要調(diào)控作用[11-12]，兒童骨肉瘤組織中miR-22-3p 與eIF4E、Ki67的相關(guān)性也間接證實(shí)了miR-22-3p/eIF4E通路對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用[13]。有學(xué)者研究肝癌細(xì)胞系中miR-22-3p的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-22-3p的表達(dá)后對(duì)肝細(xì)胞癌的增殖有明顯的抑制作用，其可能是通過對(duì)SP1的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的[14]。miR-22-3p的下游通路及調(diào)控因子較多，如CBL/β-catenin通路[15]、HMGB1通路[16]、CFL2軸[17]等，其發(fā)揮作用與下游因子的生物學(xué)特征相關(guān)。

總之，miR-22-3p通過抑制eIF4E的表達(dá)調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的增殖。兒童骨肉瘤中miR-22-3p低表達(dá)是腫瘤進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素。