吞咽障礙動物模型研究進展

李斯錦，李彥杰，秦合偉，金小琴，牛麗

1.河南中醫藥大學，河南鄭州市 450046；2.河南省中醫院，河南鄭州市 450002

吞咽障礙是由于下頜、舌、軟腭、咽喉、食管括約肌或食管功能受損，導致進食困難，不能安全有效地把食物由口送到胃內，以取得足夠營養和水分[1]。吞咽困難是臨床常見癥狀，可發生于任何年齡，腦卒中、肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、帕金森病、口咽部神經肌肉病變如喉上神經損傷等多種疾病均可引起吞咽障礙。吞咽障礙往往伴有誤吸、肺炎、營養不良、心理和社會交往障礙等嚴重并發癥，嚴重影響患者生活質量，增加病死率。吞咽障礙的臨床研究日益受到學者重視，吞咽障礙患者的管理，如診斷、評估、治療與康復等，國內專家也達成共識[2-3]。

利用動物模型進行基礎研究，是研究吞咽障礙相關疾病病理機制及其治療機理的重要手段。經過不斷研究，已開發出多種吞咽障礙動物模型，表現與人類相似的攝食吞咽功能障礙等行為學變化。

1 實驗動物

目前用于吞咽障礙研究的動物主要有嚙齒類動物、非人靈長類動物和其他哺乳動物。根據實驗要求選擇合適的實驗動物非常重要。

1.1 嚙齒類動物

嚙齒類動物是各種疾病模型的經典實驗動物，也常用于吞咽障礙造模。Wistar 大鼠較為溫順，被用于復制腦卒中后吞咽障礙[4]和口咽部神經損傷[5]等模型。Sprague-Dawley 大鼠從Wistar 大鼠培育而成，生長發育快，適應性和對傳染病的抵抗力較強，也被選作帕金森病、腦卒中等[6]吞咽障礙動物模型。小鼠體小、易于控制，也是吞咽障礙造模的重要動物[7-8]。大、小鼠模型穩定，容易獲取，易于飼養繁殖和基因改造，壽命較短，價格較低，是吞咽障礙研究最常用的實驗動物。

1.2 非人靈長類動物

非人類靈長類動物與人類的行為、生理學特征較為相似。有研究使用獼猴作為實驗動物[9]，發現獼猴吞咽的顎骨周期較短，舌骨和甲狀腺向上運動，與人類相似，可以作為吞咽障礙研究的實驗模型。也有研究通過在環尾狐猴等猴類動物舌頭或咬肌等處植入微電極[10-13]，記錄吞咽運動時肌肉募集和感覺運動等，模擬人類吞咽行為。

1.3 其他哺乳動物

一些哺乳動物，如豬、犬、貓、兔等，也成為吞咽障礙研究模型。雌性幼豬常用于研究單側喉上神經損傷[14]或喉返神經損傷[15-17]，以及腭部麻醉導致腭感覺減退[18]等引起的吞咽障礙。纖維鼻咽喉鏡吞鋇功能檢查(fiberoptic endoscopic examination of swallowing,FEES)用于有吞咽障礙狗的吞咽功能檢查[19]，具有一定可行性；損傷狗的喉返神經也可引起吞咽障礙[20]。家兔、貓等也被用來模擬人類吞咽障礙，行淺部或深部電極植入等，可觀察吞咽運動的機制[21-24]。這些新的哺乳動物模型值得進一步研究。

2 模型制備

根據導致吞咽障礙的病因，已構建多種疾病吞咽障礙模型。比較常見的疾病模型如下。

2.1 腦卒中

腦卒中是引起吞咽障礙最常見的原因之一，腦卒中后，50%以上患者會出現吞咽困難[25]。其中最常見的是缺血性腦卒中，包括大腦中動脈在內的大腦區域局部缺血會導致吞咽困難。用線栓法誘導大鼠大腦中動脈缺血已被廣泛應用。近年來，線栓法短暫性阻塞大鼠單側大腦中動脈(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)作為一種卒中后吞咽障礙模型得到驗證[4,26]。線栓法阻塞大鼠大腦中動脈90 min 后再灌注，第14 天時可引起吞咽次數減少和吞咽延遲反應時間增加等癥狀，大鼠同側大腦皮質和皮質下組織等有典型的缺血病變，而由其他腦動脈供血的腦干和小腦等腦區沒有局部缺血；在咽反射啟動中起主要作用的喉上神經和舌咽神經咽分支，術后未受到損害；吞咽障礙主要由于大腦中動脈閉塞后，皮質或皮質下功能障礙所致。盡管病變部位對吞咽的影響尚無共識，但與人類缺血性腦卒中患者吞咽功能受損引起的咽部吞咽障礙是一致的。Gulyaeva 等[27]發現，tMCAO 大鼠除吞咽啟動延遲和吞咽次數減少外，還伴有伸舌減少和舌力減弱等特征。但tMCAO大鼠在造模術后2～3 周才出現吞咽功能受損，與人類卒中后頭幾天就能觀察到吞咽困難不一致，可能與大鼠缺血后腦細胞死亡緩慢有關，有待研究。此外，雙側頸總動脈閉塞誘導慢性腦低灌注6 周模型[28]和頸總動脈結扎模型[29]等，作為腦卒中后吞咽障礙模型也正在開發與驗證。

2.2 ALS

SOD1-G93a轉基因小鼠是ALS口腔期吞咽障礙[30]和咽期吞咽障礙[31]的有效模型。其中口腔期吞咽障礙表現為舔吮和咀嚼率下降，腦干三叉神經和舌下神經核液泡樣變性；咽期吞咽障礙表現為需要更高頻率電刺激刺激喉上神經，以誘發吞咽動作，腦干疑核和孤束核液泡樣變性。

Osman 等[32]比較低拷貝數(low copy number,LCN)和高拷貝數(high copy number,HCN)轉基因超氧化物歧化酶1 (superoxide dismutase 1,SOD1)小鼠ALS 模型的吞咽困難表現，透視熒光吞咽檢查(videofluoroscopic swallowing study,VFSS)和組織形態學研究發現，與對照組相比，HCN-SOD1和LCN-SOD1小鼠舔速率、吞咽速率、吞咽間期和咽轉運時間均有明顯變化；而與同齡對照組相比，LCN-SOD1小鼠舌質量、舌背表面積、總舌長和尾舌長度降低，與人類ALS患者的吞咽困難、舌萎縮和舌下神經核病變類似，對ALS吞咽障礙研究更有復制價值。

2.3 帕金森病

帕金森病是臨床常見的神經退行性病變之一，已有多種帕金森病吞咽障礙動物模型。將神經毒素6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)注入大鼠單側前腦內側束誘導黑質紋狀體多巴胺耗竭[33-35]，以及PINK1基因敲除大鼠模型[36]，這些模型均有舌感覺和運動功能減弱等吞咽障礙表現，可作為帕金森病吞咽障礙模型。

2.4 口咽部神經肌肉病變

口咽部神經肌肉損傷或感覺障礙等也可導致吞咽困難。目前外周神經肌肉損傷導致吞咽障礙的模型主要有單側舌下神經切斷小鼠模型[37]、喉返神經損傷[38-39]或喉上神經損傷[14]等動物模型，以及通過咽腭部局部麻醉使腭感覺減退的幼豬吞咽障礙模型[18]。這些損傷在動物中相對比較容易復制。

3 吞咽功能的評價和監測

吞咽功能評定主要測量實驗動物的吞咽次數、吞咽延遲反應、誤吸、舌肌活動、喉部運動等方面的表現，是判斷造模成功與否的重要標準。

3.1 VFSS

VFSS 是人類吞咽障礙檢查的金標準，能識別沒有臨床癥狀的隱形誤吸，但也有輻射危險[40]，且有運動或其他功能障礙的患者往往無法配合完成。在動物模型中使用VFSS 具有不受輻射和肢體功能限制等優點，同時可以植入無線電不透明標記等，對吞咽運動進行詳細的運動學分析。Best 等[10]用皮下針將3 個直徑0.5 mm 的鉭球植入雌性恒河猴的舌前、中、后區域，對C 臂熒光鏡進行改造，以100 幀/s 速率獲得猴頜骨和舌運動的二維側視視頻，采用半自動標記跟蹤算法，提示VFSS 經改進，可以應用于研究各種吞咽障礙模型的吞咽參數。Lever等[41]開發了小鼠VFSS 協議，用于測試腦卒中、帕金森病、ALS等疾病引起的吞咽障礙，包括定制設計一個使小鼠可以自由活動的觀察室，調制出能掩蓋造影劑難聞氣味以保證小鼠攝取充分密度的含造影劑食物，以及分步測試以最大程度提高動物依從性，從而保證小鼠VFSS 順利進行。與人類相比，鼠VFSS可以較高速率成像(100～500幀/s)，能量化多種吞咽參數。

3.2 肌電圖

臨床上檢測吞咽障礙患者大多應用無創的表面肌電圖，很少使用侵入性針極肌電圖，所以只能評估表淺肌肉的功能，而無法評估對吞咽至關重要的舌肌、舌骨下肌群和舌骨上肌群[42]。動物模型可以通過插入針極電極或植入電極，測量深部吞咽相關肌肉在靜息和吞咽運動時的生物電信號，評估吞咽功能。Vinyard 等[11]將雙極留置電極插入環尾狐猴的咬肌中，記錄清醒狀態下咀嚼食物時的肌肉募集活動，通過比較峰值時間研究咬肌在咀嚼周期中的募集和活動模式。Lang等[43]將電極置于貓的咽、喉和食道，證實食管酸化對食管上括約肌松弛和收縮等食管反射的影響。DeLozier 等[44]將電極植入喉返神經損傷幼豬的舌肌、舌骨上肌群和舌骨下肌群，記錄肌肉運動與口腔期食團活動的相關性，證實喉返神經損傷對幼豬口咽肌活動和感覺運動整合的影響。Tsujimura等[45]將電極插入雙側舌下神經和喉返神經損傷大鼠的舌骨上肌群和舌肌，分析刺激喉部誘發的吞咽肌電信號變化等，觀察舌下神經和喉返神經對吞咽功能的影響，具有可行性。

3.3 神經電刺激與肌電圖聯合評估

電刺激特定的神經，如喉上神經、喉返神經等，被廣泛用于誘發動物模型的吞咽反射，常與肌電圖聯合應用，研究吞咽功能的神經調控。Tsuji等[46]電刺激喉上神經、喉返神經和皮質吞咽區，誘發吞咽動作，肌電圖記錄左下頜舌骨肌電活動，結果表明，持續刺激誘發的吞咽頻率逐漸減少，以持續刺激喉上神經最為明顯，可能提示自主吞咽在起始反應上有顯著差異。Satoh 等[47]通過重復電刺激喉上神經誘導麻醉大鼠吞咽反射，記錄下頜舌骨肌電活動，提示紅核參與吞咽的控制。Tsujimura等[48]重復電刺激皮質咀嚼區a 區和p 區以及喉上神經誘發吞咽反射，記錄咬肌等肌肉的電活動，表明皮質咀嚼區a 區激活吞咽反射，而不是p區。

3.4 其他

其他評估與檢測方法有舌壓力測量、FEES、張力傳感系統檢測、神經功能學評估、目測喉部運動等；此外還可監測模型動物的體質量和進食水量等變化，以及動物的精神狀態變化等。上述檢測方法可以聯合運用。

Ciucci 等[33]利用特定裝置測量大鼠舌力和時間參數，檢測6-OHDA 單側前腦內側束注射帕金森病吞咽障礙大鼠模型的舌功能，給藥后，大鼠最大舌力和平均舌力降低，舌平均按壓時間延長，出現舌功能減退等吞咽困難癥狀。Marks 等[19]對成年狗行FEES，能觀察到鼻咽、口咽和食管的運動，以及食團在食道和胃中的推動等，是一種可行的診斷工具，但吞咽困難動物是否都能耐受還有待研究。袁清潔等[26]利用張力傳感系統觀測tMCAO 大鼠50 s內由蒸餾水引發的吞咽潛伏期和吞咽次數，觀察大鼠體質量及進食水量變化，并進行神經功能評估等，發現通咽噴霧劑可有效改善大鼠的吞咽功能，在改善進食水方面有較好效果。

4 小結

目前用于研究吞咽障礙的動物種類和方法越來越多，每種疾病模型都有各自的造模方法和評估檢測指標，麻醉劑的選擇和劑量也不統一，需要研究者基于研究目的和方向進行選擇。理想的吞咽障礙模型應具有臨床相似性、可操作性、可重復性和可調控性，迄今尚無任何動物模型可以完美復制人類吞咽障礙的表型。隨著定向遺傳基因修飾等技術的發展，不同檢測指標的聯合使用，人們對于吞咽障礙機制的認識也將更為深刻；利用吞咽障礙模型探索吞咽障礙的病理生理及吞咽動力學等，將為吞咽障礙的藥物治療研究以及新治療靶點的發現提供更多可能。目前許多治療吞咽障礙的中醫藥療法有待驗證，應用吞咽障礙動物疾病模型，挖掘中醫藥治療吞咽障礙的新療法有廣闊前景。

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